枝霉MD2紫杉醇合成相关候选基因A11450和A02725的超表达研究

发布时间：2020-07-02 11:56

【摘要】：紫杉醇是一种广谱、高效、低毒的抗癌药物。产紫杉醇内生真菌是重要的紫杉醇药源之一。但目前发现的产紫杉醇内生真菌存在紫杉醇产量低等问题,尚无法实现其工业化应用。高表达真菌的紫杉醇合成限速酶基因和调控基因,构建紫杉醇稳定高产的基因工程菌株是实现其工业化应用的主要途径之一。但目前真菌紫杉醇合成途径及其相关基因的研究极少,严重限制了高产工程菌株的创建。因此,克隆真菌紫杉醇合成相关基因并研究其功能,已成为利用基因工程技术提高真菌紫杉醇产量的关键。本研究以产紫杉醇真菌枝状枝孢霉(简称:枝霉)(Cladosporium cladosporioides)MD2为对象,选取了2个候选基因A11450和A02725,克隆了A02725并对A02725进行了生物信息学分析,分别构建了这两个候选基因的超表达载体,并获得相应的转基因菌株,通过检测转基因菌株中紫杉烷类的合成情况,分析了超表达候选基因A11450和A02725对宿主紫杉烷合成的影响,为深入揭示这两个基因的功能以及高产菌株的构建奠定了基础。本研究的主要结果如下:(1)克隆了候选基因A02725的DNA全长序列并采用多个在线软件对其进行了结构和功能预测。候选基因A02725的DNA全长序列为1524 bp,不含内含子,其编码蛋白与Cercospora zeina的r{牛儿r{牛儿焦磷酸合成酶(Geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS)一致性为62%,该蛋白不含跨膜结构,无信号肽,含有聚戊烯基合成(Polypentenyl synthetic)结构域。(2)以pTFCM为基本框架构建了候选基因A11450的超表达载体,采用农杆菌介导法转化枝霉MD2,成功获得了A11450-转基因菌株25株。采用Southern blot技术分析转基因菌株中外源基因的拷贝数,并随机选择了三株外源基因以单拷贝方式整合的A11450-转基因菌株4-6、4-19及4-20,QRT-PCR检测候选基因A11450的表达量,然后选取基因表达量相对最高的4-20菌株提取紫杉烷类产物进行了HPLC分析。结果表明,A11450-转基因菌株的10-去乙酰巴卡亭III、巴卡亭III及紫杉醇产量是对照菌株(未转基因菌株)的1.24-1.36倍;说明超表达候选基因A11450可提高枝霉MD2 10-去乙酰巴卡亭III、巴卡亭III及紫杉醇的产量。(3)构建了候选基因A02725的超表达载体,采用农杆菌介导法转化枝霉MD2,共获得A02725-转基因菌株18株。Southern blot验证候选基因A02725的拷贝数。随机选择三株外源基因以单拷贝方式整合的A02725-转基因菌株7-10、7-14及7-18,并采用QRT-PCR检测候选基因A02725的表达量,结果表明7-18菌株的A02725相对表达量最高。HPLC分析7-18菌株的三种紫杉烷类,结果表明A02725-转基因菌株的10-去乙酰巴卡亭III、巴卡亭III及紫杉醇产量是对照菌株的1.34-1.44倍;说明超表达候选基因A02725可提高枝霉MD2的三种紫杉烷类的产量。以上结果初步揭示超表达候选基因A11450和A02725可促进枝霉MD2的三种紫杉烷类的合成,为后期通过基因敲除分析以及体外催化功能分析深入揭示这两个基因的功能奠定基础。
【学位授予单位】：中南民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q93;Q78

【参考文献】