卷丹珠芽形成机理解析及LlAGO1基因克隆

发布时间：2020-07-02 12:28

【摘要】：卷丹(Lilium lancifolium),又称宜兴百合、虎皮百合,百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)植物,分布于中国17个省区。该种花大色艳,抗性强,兼具观赏、食用、药用价值,为我国传统食用百合和药用百合的主要种类之一。卷丹是天然的三倍体,不产生种子,但在茎的中上部叶腋处可产生紫黑色珠芽。珠芽繁殖不仅能较好地保留母体的遗传特征,且较鳞片扦插和籽球繁殖简便,繁殖效率高,因此成为卷丹种群扩展最主要的繁殖策略。目前,关于植物珠芽形成的信息较少。在百合中仅见于解剖学等方面一些初步研究,尽管有些与珠芽形成相关的基因被克隆,但百合珠芽是如何形成的,为何珠芽仅着生于茎中上部的叶腋处,珠芽发生涉及到哪些基因和代谢通路等一系列科学问题均未得到很好研究,至今,其形成机理尚不清楚。本研究以三倍体卷丹为试验材料,通过对其珠芽形成过程的解剖学、转录组学、生理学等进行分析,系统地探索研究了调控珠芽形成的机制,在此基础上,筛选出珠芽形成相关的基因进行了全长克隆及生物信息分析,以期为人工调控珠芽形成,有效提高百合繁殖系数奠定理论基础。主要研究结果如下:1.卷丹珠芽形成的形态学与解剖学研究。通过形态学观察、石蜡切片法对卷丹珠芽的发生规律及形成过程的解剖结构特征进行了研究。结果表明卷丹珠芽形成于地上茎与叶片连接的叶腋处,是由叶腋处叶柄基部近轴侧表皮下层的薄壁细胞分裂分化而来。叶柄基部近轴端凸起,定义为珠芽的启动,是卷丹珠芽形成过程的首个重要变化。卷丹珠芽首先在茎上部某一叶腋处形成,之后其上位叶依次形成珠芽。2.卷丹珠芽形成过程中激素和糖代谢研究。通过蒽酮比色法对卷丹珠芽形成过程不同阶段的上、下叶腋中的淀粉和可溶性糖含量进行了测定,结果显示上叶腋中淀粉含量高于下叶腋,且在上部叶腋珠芽启动过程中,可溶性糖含量下降,而淀粉含量上升。通过酶联免疫法测定了IAA、ZR、ABA和GAs在卷丹珠芽形成过程中的含量变化,结果显示,生长素的变化最为显著,在珠芽启动时含量上升,后期形成阶段含量下降,而ZR和ABA在珠芽形成过程中含量下降,GAs则在启动和形成过程中,含量缓慢增加。3.卷丹珠芽形成转录组数据的序列拼接、基因功能注释和分类。利用Illumina高通量测序技术对卷丹珠芽形成过程的三个阶段(S1:茎上部叶腋未长珠芽;S2:茎上部叶腋凸起;S3:茎上部叶腋刚形成珠芽结构)的茎上部叶腋组织及S2阶段的下部叶腋进行了转录组测序,最终获得64,971万个raw reads,过滤后得到59,806万个clean reads,进行De novo拼接后获得389,636个contigs和293,858个非冗余的unigenes,平均读长549 bp,N50为752 bp。对Unigenes进行功能注释和分类,GO分类将67,672个unigenes分为56个功能组。COG将36,214个unigenes分为26类。KEGG分类将34,491个unigenes归于132个具体的通路。4.差异表达基因的筛选及功能富集分析。将卷丹上叶腋珠芽形成的三个阶段进行两两比较,并对S2阶段的上叶腋与下叶腋进行比较,共得到11,871个差异表达基因。差异基因的表达主要发生于珠芽形成的启动阶段,且珠芽的启动多为上调基因作用的结果。对差异基因进行GO功能富集,结果表明上叶腋珠芽的启动和形成主要富集于代谢过程,而上、下叶腋的差异基因主要富集于分子功能组中的催化活性及生物过程中的淀粉代谢过程、蔗糖代谢过程和蛋白质磷酸化。差异表达基因的KEGG富集结果显示,淀粉和糖代谢通路及激素信号转导通路在珠芽形成过程中发挥重要作用。珠芽的启动伴随着淀粉的合成。植物激素在不同的样品中表现出不同的表达模式。其中生长素与珠芽的启动呈正相关,但抑制卷丹珠芽的进一步形成。5.卷丹LlAGO1基因的克隆与生物信息学分析。利用卷丹转录组数据中的基因片段信息,筛选出注释为AGO1的差异表达基因,根据该基因的保守序列设计引物,通过RACE技术从卷丹中分离到AGO1基因,命名为LlAGO1。LlAGO1全长4014 bp,其中开放阅读框长3684 bp,编码1227个氨基酸残基,其编码蛋白分子量为135.36 kD,理论等电点(pI)为9.57。LlAGO1与相关同源蛋白高度相似,且与芦笋AGO1a蛋白(XP_020260210.1)亲缘关系最近。蛋白质理化性质分析表明,LlAGO1为不稳定的亲水的非分泌蛋白,无跨膜结构,不能形成卷曲螺旋;氨基酸序列分析表明LlAGO1含有PAZ和PIWI两个AGO1典型的结构域;亚细胞定位预测表明主要定位于细胞核;预测其可能参与转录调控。6.LlAGO1基因的表达分析。qRT-PCR分析结果表明LlAGO1在卷丹叶腋、鳞片、根、叶片等不同组织部位均有表达,其中在叶腋中的表达量最高,根中的表达量最低。此外,卷丹LlAGO1基因的表达具有时空性,即LlAGO1仅在卷丹可形成珠芽的上部叶腋表达,且在珠芽形成过程中表达量逐渐升高,而在不形成珠芽的下部叶腋几乎不表达。
【学位授予单位】：南京林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S682.29

【参考文献】