AIF1L基因对MDAMB231乳腺癌细胞迁移侵袭的影响及机制研究

发布时间：2020-07-04 03:21

【摘要】：目的:乳腺癌是女性发病率高居首位的恶性肿瘤,全球每年约170万人罹患该肿瘤。根据2012年数据,全球每年大约有50万人死于乳腺癌。尽管乳腺癌的诊断和治疗已经取得了很大进展,但由于肿瘤复发和远处转移仍可导致大量患者预后不良。因此,从分子水平深入认识乳腺癌侵袭和转移的机制,明确与之相关的调控基因,对进一步改善乳腺癌的治疗将具有重要意义。同种异体移植炎症因子1样(AIF1L,Allograft inflammatory factor-1 like)蛋白是一类具有EF手型模序结构的钙结合蛋白。AIF1L基因定位于9q34.13,由5个外显子和4个内含子组成,基因全长3455bp,其中开放阅读框架453bp,共编码150氨基酸,其中含有一个潜在的磷酸化位点和一个潜在的乙酰化位点,分子量约为17.0kDa,等电点6.63。AIF1L基因在肾脏中表达最高,正常乳腺组织中中度表达,低表达于脑、脾脏、肺、骨骼肌和睾丸,而在肝脏中未检测到其表达。既往研究发现AIF1L蛋白能够结合和交联F-actin,并和F-actin共定位,而且AIF1L也定位于细胞突起和粘附结构区。在志贺氏菌侵袭模型上,可见大量细胞骨架的重排,同时也发现AIF1L被募集到细胞片状伪足。也有研究发现AIF1L是足细胞特异表达基因,使用siRNA沉默AIF1L,会导致F-actin压力纤维明显的缺失和重排,同时伴随CD2AP和SYNPO的表达下调,两者对维持足细胞骨架的稳定性尤为重要。这些研究表明AIF1L参与细胞骨架结构的调控,但其在肿瘤中的作用尚不清楚。到目前为止,尚未发现AIF1L在乳腺癌中表达的表型特征,其对乳腺癌发生和转归的影响以及相关分子机制尚不清楚,本研究利用公共数据库分析了AIF1L表达特征,并分析预测了其生物学功能,在此基础上,进一步观察了AIF1L在乳腺癌组织中的表达特征,分析了AIF1L与乳腺癌发生和转归的关系,并探讨了相关分子机制。研究方法:1、采用生物信息学方法评估AIF1L在TCGA、HPA、GEO数据库中乳腺癌组织的表达,通过DAVID和GSEA分析CCLE数据库,推测AIF1L基因的生物学功能及其相关信号通路。2、采用免疫组织化学染色方法检测287例乳腺癌组织及44例癌旁非癌组织中AIF1L的表达,并分析其与乳腺癌临床病理相关因素和患者预后的关系。3、使用携带AIF1L基因(或对照)的腺病毒载体转染MDAMB231细胞,通过MTT实验和平板克隆形成实验,评估AIF1L基因对MDAMB231细胞增殖能力和干性的影响;通过划痕愈合实验、Transwell迁移侵袭实验,评估AIF1L基因对MDAMB231细胞迁移和侵袭能力的影响;通过细胞伸展实验,评估AIF1L基因对MDAMB231细胞形态的影响。采用Western blot方法评价AIF1L基因对FAK-RhoA信号通路及EMT相关信号通路的影响。4、实验所得数据使用SPSS 19.0软件或R语言软件等分析,实验图片处理采用ImageJ软件,采用Graphpad软件绘制图表。计数资料采用行×列表的χ2检验或Fisher精确检验,生存分析采用Kaplan-Meier及log-Rank检验,多因素生存分析采用Cox回归分析。检验水平α=0.05。结果:1、TCGA数据库乳腺癌中AIF1L mRNA的表达明显低于正常组织,而乳腺癌中甲基化水平高于正常组织。2、HPA数据库中AIF1L主要表达于腺上皮细胞的细胞浆和细胞膜,且正常组织较乳腺癌组织表达高。3、GEO数据库中AIF1L在肿瘤中表达均低于正常对照组。4、DAVID分析和GSEA分析提示AIF1L基因与紧密连接、细胞骨架、细胞粘附等信号通路相关。5、AIF1L的阳性免疫反应主要定位于细胞膜和细胞浆。乳腺癌中AIF1L的表达率(28.6%,82/287)显著低于癌旁非癌组织中的阳性率(58.3%,28/48)(p=0.007)。AIF1L在三阴性乳腺癌中表达较低。AIF1L低表达组与高表达组相比预后差,AIF1L高表达是乳腺癌预后的保护因素。6、AIF1L基因可抑制MDAMB231细胞增殖能力、克隆形成能力、细胞迁移及侵袭能力以及细胞伸展水平,该作用可能是通过抑制FAK-RhoA信号通路蛋白表达及活化,逆转癌细胞上皮间质转化EMT表型而实现。结论:1、生物信息学分析发现人乳腺癌组织中AIF1L的表达明显低于正常组织,且在三阴性乳腺癌中表达最低;AIF1L参与多种信号通路,如紧密连接、细胞粘附、细胞骨架调节等,其可能在乳腺癌发生发展过程中发挥重要的生物学功能。2、免疫组化研究发现乳腺癌组织中AIF1L蛋白表达显著低于癌旁非癌组织;AIF1L在三阴性乳腺癌组织显著降低。AIF1L高表达的乳腺癌患者预后明显好于AIF1L低表达患者,AIF1L高表达是乳腺癌患者的保护性预后因素。3、AIF1L可能通过抑制FAK-RhoA信号通路,抑制上皮间质转化相关通路,进而抑制癌细胞的迁移和侵袭,发挥抑癌基因的作用。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9
【图文】：

肿瘤细胞系,百科全书,种细胞,详细信息

图 1.1 肿瘤细胞系的百科全书（CCLE）中细胞来源分类59 种细胞系详细信息见表 1.1。肿瘤细胞系来自于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ，Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen )，美国模式菌种收集中心(ATCC，American type culture collection)和日本生物资源收集中心(JCRB，Japanese Collection of Research Bioresources)细胞库，永生化的乳腺上皮细胞 HMEL来自于 Achilles 实验室。细胞系相关信息来自于各个网站或者查询文献获得[17-20]。表 1.1 CCLE 数据库中乳腺细胞系及其特征CCLE 名字细胞系分子分型组织学类型来源AU565_BREAST AU565 HER2amp ATCCBT20_BREAST BT-20 TNBC ductal_carcinoma ATCCBT474_BREAST BT-474 HER2amp ductal_carcinoma ATCCBT483_BREAST BT-483 Luminal ductal_carcinoma ATCCBT549_BREAST BT-549 TNBC ductal_carcinoma ATCCCAL120_BREAST CAL-120 Luminal B DSMZCAL148_BREAST CAL-148 Luminal A ductal_carcinoma DSMZCAL51_BREAST CAL-51 DSMZ

数据库,脾脏,红髓,免疫细胞

3 结果3.1 HPA 数据库中 AIF1L 蛋白的表达通过检索 HPA 数据库 AIF1L 在多种组织中的表达，免疫组织化学结果发现AIF1L 在肾脏中肾小球和肾小管均高表达，在子宫内膜腺管、乳腺导管上皮、贮精囊腺上皮和附睾腺上皮、大脑皮层的内皮细胞、皮肤的生黑色素细胞和表皮细胞、尾状核的神经细胞、甲状腺上皮细胞、甲状旁腺上皮细胞、结肠腺上皮细胞、唾液腺上皮细胞等中-低表达，其他组织多为阴性，偶可见极低表达，见图 1.2。另外在脾脏红髓和白髓的免疫细胞中未见 AIF1L 的表达，但于内皮细胞中呈强表达。而AIF1 主要表达于骨髓及免疫系统中的免疫细胞，如阑尾、骨髓中造血细胞、淋巴结、扁桃体和脾脏红髓，见图 1.3。肺脏巨噬细胞中 AIF1 也存在高表达。AIF1 和 AIF1L在脾脏中的表达见图 1.4。

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