DPT、SPON1基因过表达对人肝癌细胞SK-Hep-1、HepG2增殖及侵袭迁移的影响

发布时间：2020-07-04 03:24

【摘要】：目的研究皮肤桥蛋白(DPT)和底板反应蛋白(SPON1)基因过表达后对肝癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响,探讨DPT、SPON1基因在肝癌发生发展过程中的作用,为肝癌侵袭转移提供新的生物学指标及基因治疗提供新的靶点。方法1、肝癌细胞株SK-Hep-1、HepG2及正常人肝细胞株L-02中DPT、SPON1基因及蛋白表达的检测:三种细胞培养,并抽提其总RNA,反转录成cDNA,采用qPCR检测DPT、SPON1基因的本底表达。提取三种细胞样本中的总蛋白,采用western blot检测其中DPT、SPON1蛋白的本底表达。2、含DPT、SPON1基因慢病毒质粒载体的包装及肝癌细胞的转染:将DPT、SPON基因慢病毒表达载体pLenti6.3-DPT-IRES-EGFP、pLenti6.3-SPON1-IRES-EGFP分别与包装质粒共转染293T细胞,进行目的基因过表达的慢病毒包装。确定包装成功后分别用含DPT、SPON1过表达慢病毒的293T细胞的培养液及慢病毒阴性对照病毒液Lenti-EGFP感染靶细胞SK-Hep-1、HepG2。实验设空白对照组、空质粒阴性对照组(NC组)和目的基因过表达组,qPCR检测转染细胞DPT、SPON1基因的表达,WB检测转染细胞DPT、SPON1蛋白的表达。3、转染肝癌细胞的增殖及迁移侵袭能力检测:CCK-8实验检测细胞的增殖情况,转染肝癌细胞在不同时间点(1D、2D、3D、4D、5D)用酶标仪读取450nm处的吸光值(OD值),根据OD值结果计算细胞的生长活力变化。Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力,实验中细胞转入Transwell小室24小时后固定染色,用酶标仪读取OD值,比较细胞的迁移能力。细胞转入铺备基质胶的Transwell小室48小时后固定染色,用酶标仪读取OD值,比较细胞的侵袭能力。结果1、qPCR检测DPT、SPON1基因在肝癌细胞SK-Hep-1、HepG2及正常人肝细胞株L-02的表达:结果显示,DPT基因及蛋白在肝癌细胞SK-Hep-1、HepG2中表达均低于正常人肝细胞株L-02,在SK-Hep-1中最低,故选表达最低的肝癌细胞株SK-Hep-1作为研究DPT基因过表达对肝癌细胞增殖迁移能力的后续实验。SPON1基因及蛋白在肝癌细胞SK-Hep-1、HepG2中表达均低于正常人肝细胞株L-02,在HepG2中最低,故选取HepG2细胞作为SPON1基因过表达后续实验。2、慢病毒转染细胞的形态学观察:携带荧光标记的DPT、SPON1过表达慢病毒分别转染SK-Hep-1、HepG2细胞后48h,荧光显微镜下观察,可见绿色荧光信号明显,细胞生长状态良好,说明转染成功。3、转染细胞的表达:采用qPCR分别检测SK-Hep-1细胞DPT基因及HepG2细胞中SPON1基因的表达。结果表明:在SK-Hep-1细胞实验中,与空白组和NC组相比,实验组(过表达组,SK-Hep-1-DPT)细胞中的DPT基因表达显著上调(P0.01);在HepG2细胞实验中,与空白组和NC组相比,实验组(过表达组,HepG2-SPON1)细胞中SPON1基因表达同样显著上调(P0.01);说明两种过表达慢病毒包装成功。4、转染细胞的DPT、SPON1蛋白表达:慢病毒介导的目的基因转染靶细胞后提取总蛋白,WB检测发现,DPT蛋白在过表达组(SK-Hep-1-DPT)细胞中表达显著高于空白组和NC组(P0.05);SPON1蛋白在过表达组(HepG2-SPON1)细胞中表达同样高于空白组和NC组(P0.01)。进一步证明两种过表达慢病毒包装成功。5、CCK-8法检测转染肝癌细胞的增殖:CCK-8法分别检测三组细胞在不同时间点的增殖情况,结果显示,与空白组和NC组相比,过表达DPT组(SK-Hep-1-DPT)细胞的增殖活力显著受到抑制(P0.05)。过表达SPON1组(HepG2-SPON1)细胞的增殖活力同样受到抑制(P0.05)。说明过表达DPT和SPON1显著抑制肝癌细胞的增殖。6、Transwell实验检测转染肝癌细胞的迁移和侵袭:结果显示,与空白组和NC组对比,过表达DPT组(SK-Hep-1-DPT)细胞的迁移和侵袭能力受到显著抑制(P0.05)。过表达SPON1组(HepG2-SPON1)细胞的迁移和侵袭能力也明显受到抑制(P0.01)。说明过表达DPT和SPON1显著抑制肝癌细胞的转移。结论1、DPT基因及蛋白在SK-Hep-1细胞中本底表达最低,选取SK-Hep-1细胞作为DPT过表达及影响肝癌细胞增殖、迁移侵袭能力的后续实验;SPON1基因及蛋白在HepG2细胞中本底表达最低,选取HepG2细胞作为SPON1过表达及影响肝癌细胞增殖、迁移侵袭能力的后续实验。2、两种目的基因过表达慢病毒载体分别转染两种肝癌细胞株后,DPT、SPON1基因及蛋白表达显著上调,说明过表达慢病毒包装成功。3、CCK-8实验结果显示过表达DPT基因显著抑制SK-Hep-1细胞的增殖,过表达SPON1基因显著抑制HepG2细胞增殖。说明过表达DPT和SPON1显著抑制肝癌细胞的增殖。4、Transwell实验结果显示过表达DPT基因显著抑制SK-Hep-1细胞迁移侵袭能力,过表达SPON1基因显著抑制HepG2细胞迁移侵袭能力。说明过表达DPT和SPON1显著抑制肝癌细胞的转移。
【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7
【图文】：

结 果检测 SK-Hep-1、HepG2、L-O2 细胞中 DPT、SPON检测 DPT 基因在肝癌细胞 SK-Hep-1、HepG2 中表达2，在 SK-Hep-1 中最低（图 1-3）；进一步检测 DPT达，结果显示，DPT 蛋白在 SK-Hep-1、HepG2 肝癌常人肝细胞株 L-02，在 SK-Hep-1 中最低（图 1-6）的肝癌细胞株SK-Hep-1作为研究DPT基因过表达对续实验。SPON1 基因在正常人肝细胞株 L-02 中表达（图 1-4）。进一步检测 SPON1 蛋白在三种细胞中的N1 蛋白同样在正常人肝细胞株 L-02 中表达最高，在故选取 HepG2 细胞作为 SPON1 基因过表达后续实验

移能力的后续实验。SPON1 基因在正常人肝细胞株 L-02 中表达最高，在 HepG2细胞中最低（图 1-4）。进一步检测 SPON1 蛋白在三种细胞中的本底表达，结果显示，SPON1 蛋白同样在正常人肝细胞株 L-02 中表达最高，在 HepG2 中最低（图 1-7）。故选取 HepG2 细胞作为 SPON1 基因过表达后续实验。图 1-1. SK-Hep-1、Hepg2、L-O2 细胞的 RNA 抽提电泳图

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 陆俭;马超;蒋琳;;bcl-2基因过表达的中国仓鼠卵巢细胞株的建立[J];中国生物制品学杂志;2009年02期

2 费敏;李平;赵婷婷;孙斯凡;古艳婷;王华;张浩军;杨靖;;EPHX2基因过表达质粒的构建及意义探讨[J];中国中西医结合肾病杂志;2014年02期

3 徐广峰;赵亚萍;陈小慧;高春林;王建国;郭锡熔;;NYGGF4基因过表达对脂肪细胞线粒体的影响[J];临床检验杂志;2011年04期

4 王平;陈祥俊;郑金娥;杜雯;刘伟;张佳华;姚军霞;李小青;贺艳丽;;SARI基因过表达对K562细胞系生物学影响的研究[J];中国实验血液学杂志;2015年03期

5 ;油酸可抑制ERBB2癌基因过表达[J];河南医学研究;2005年02期

6 王小仲;p27KIP1基因过表达诱导HCC-9204细胞在G1期停滞并导致细胞凋亡[J];第四军医大学学报;2003年09期

7 李江,于欣欣,杨新科,葛蒙梁,张杰,王文亮;Bax基因过表达诱导肝癌细胞凋亡[J];中华消化杂志;2001年02期

8 高月;邓小芳;雷继魁;;ALEX1基因过表达慢病毒载体的构建和鉴定[J];中国免疫学杂志;2016年05期

9 刘艳;程明忠;潘传鼎;;bcl-2基因过表达对小鼠MCAO模型的保护作用[J];神经损伤与功能重建;2008年03期

10 姜华;南岩东;房延凤;金发光;杨拴盈;;S100A6基因过表达促进肺腺癌裸鼠移植瘤生长及其机制研究[J];现代肿瘤医学;2017年06期

相关会议论文 前10条

1 苗莉;刘健胜;王玫瑰;闫京京;卢思广;;STIM1及ORAI1基因过表达载体的建立及其对足细胞相关蛋白的影响[A];中华医学会第十七次全国儿科学术大会论文汇编（下册）[C];2012年

2 何若洁;石磊;叶城辉;戴佳颖;何柏萱;姚晓黎;;基于诱导多能干细胞模型探究PMP22基因过表达在CMT1A发病中的作用[A];中华医学会第十八次全国神经病学学术会议论文汇编（下）[C];2015年

3 季晨博;史春梅;陈玲;杨蕾;朱金改;郭锡熔;;NYGGF4(PID1)基因过表达对脂肪细胞线粒体代谢的影响[A];2012年江浙沪儿科学术年会暨浙江省医学会儿科学分会学术年会、儿内科疾病诊治新进展国家级学习班论文汇编[C];2012年

4 辜楠;郭锡熔;潘晓勤;费莉;陈荣华;;Resistin基因过表达影响3T3-L1脂肪细胞的脂质代谢[A];2006（第三届）江浙沪儿科学术会议暨浙江省儿科学术年会论文汇编[C];2006年

5 季晨博;史春梅;陈玲;杨蕾;朱金改;郭锡熔;;NYGGF4(PID1)基因过表达对脂肪细胞线粒体代谢的影响[A];中华医学会第十七次全国儿科学术大会论文汇编（下册）[C];2012年

6 汪怡;张锦生;黄光存;钱瑾;陈琦;赵仲华;;肾上腺髓质素与转化生长因子β1之间的关系及其基因过表达对肝星状细胞生物学行为的影响[A];中华医学会病理学分会2005年学术年会论文汇编[C];2005年

7 顾晓琪;郭锡熔;辜楠;郭锡熔;倪毓辉;王玢;张敏;刘峰;费莉;陈荣华;;Resistin基因过表达影响3T3-L1脂肪细胞的脂质代谢[A];中华医学会第十四次全国儿科学术会议论文汇编[C];2006年

8 王涛;许均华;汪显国;武翔鹏;邱红玲;李文鑫;;人ZNF300基因过表达通过激活NF-κB通路促进肿瘤细胞增殖和移[A];中国病理生理学会受体、肿瘤和免疫专业委员会联合学术会议论文汇编[C];2010年

9 刘小辉;彭小东;胡珍珍;赵清梅;何健;黎军和;钟小军;;ANXA10基因过表达对人肝癌细胞株HepG2的影响[A];中华医学会肿瘤学分会第七届全国中青年肿瘤学术会议——中华医学会肿瘤学分会“中华肿瘤 明日之星”大型评选活动暨中青年委员全国遴选论文汇编[C];2011年

10 沈捷;;CRELD1基因过表达对心脏瓣膜相关基质蛋白的影响[A];中华医学会第十七次全国儿科学术大会论文汇编（下册）[C];2012年

相关博士学位论文 前10条

1 葛锦峰;IDO基因过表达诱导小鼠肺移植慢性排异免疫耐受的实验研究[D];苏州大学;2012年

2 晏丕军;JAZF1基因过表达对糖—脂代谢和动脉粥样硬化的影响[D];重庆医科大学;2012年

3 王克玲;FOXP3基因过表达腺病毒转染未成熟树突状细胞对实验性变态反应性脑脊髓炎免疫耐受作用的研究[D];河北医科大学;2011年

4 汪凯;Mash1基因过表达的骨髓间充质干细胞治疗癫痫的实验研究[D];第四军医大学;2014年

5 张洁;细胞色素P450表氧化酶2J2基因过表达及与可溶性环氧化酶解酶抑制剂共同作用治疗小鼠2型糖尿病的作用及其机制[D];华中科技大学;2012年

6 季青山;EphA2基因过表达对氧化应激诱导的人晶状体上皮细胞损伤的保护作用[D];暨南大学;2014年

7 张韵婷;EBP50基因过表达对胰腺癌SW1990细胞作用的机制研究[D];武汉大学;2016年

8 张洁;细胞色素P450表氧化酶2J2基因过表达及与可溶性环氧化酶水解酶抑制剂共同作用治疗小鼠2型糖尿病的作用及其机制[D];华中科技大学;2012年

9 陈文树;细胞色素P450表氧化酶2J2基因过表达通过抗炎、抗氧化应激、抗凋亡减轻肺缺血再灌注损伤[D];华中科技大学;2014年

10 张莎莎;细胞色素P450表氧化酶2J2基因过表达通过增加脂肪酸氧化改善小鼠高脂血症[D];华中科技大学;2015年

相关硕士学位论文 前10条

1 刘宇平;DPT、SPON1基因过表达对人肝癌细胞SK-Hep-1、HepG2增殖及侵袭迁移的影响[D];广州医科大学;2018年

2 慈红非;KAI1基因过表达对非小细胞肺癌细胞增殖、侵袭及迁移的影响[D];蚌埠医学院;2018年

3 李伟;慢病毒介导的PTPRR基因过表达和沉默小鼠模型与抑郁发生的关系研究[D];山西医科大学;2015年

4 雍翔;WISP2基因过表达对食管癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响[D];蚌埠医学院;2015年

5 杨纯平;DEC1基因过表达对人食管癌ECA109细胞增殖及侵袭能力的影响[D];重庆医科大学;2015年

6 卢园园;Aiolos基因过表达对白血病细胞生物学特性及化疗敏感性的影响[D];山东大学;2014年

7 赵孝金;H8对11β-HSD1基因过表达小鼠脂肪合成及分解相关酶影响的实验研究[D];牡丹江医学院;2017年

8 周苹;GH3.9基因过表达对拟南芥生长发育的影响研究[D];湖南大学;2013年

9 林志敏;BMP-9基因过表达对小鼠糖脂代谢的影响[D];重庆医科大学;2016年

10 王为;gax基因过表达对自体移植静脉平滑肌细胞增殖的抑制作用[D];中国医科大学;2004年

本文编号：2740567