AAV介导的人FⅧ重链与大鼠FⅧ轻链基因治疗血友病甲的研究

发布时间：2020-07-04 05:34

【摘要】：研究目的:血友病甲(HA)的基因治疗,可以克服传统替代疗法的弊端,并且通过构建有较高表达效率的FⅧ表达元件,从而降低转运载体(AAV)的剂量,降低免疫反应,可在一定程度上减少抑制物的形成。关于提高FⅧ的表达效率,除密码子优化策略以外,也有研究表明,不同物种来源的FⅧ,其生物学活性可比人FⅧ(hFⅧ)活性高,然而关于比较大鼠FⅧ(rFⅧ)与hFⅧ活性的研究未见相关报道,并且基于rFⅧ与hFⅧ在核苷酸及氨基酸水平均有较高的同源性(分别为61%、51%),我们研究的目的是想通过比较rFⅧ与hFⅧ活性差异,通过差异氨基酸替换的方法,对hFⅧ序列进行点突变,进而期望为AAV介导的HA的基因治疗及构建有较高表达效率的FⅧ表达元件提供基础研究数据。研究方法:我们将hFⅧ-BDD-SQ、rFⅧ-BDD SQ、hHC、hLC、rHC、rLC分别克隆到带有CB promoter(泛表达)和ApoE-hAAT promoter(肝脏特异表达)的质粒表达载体中,采取单链策略及HC、LC分开的双链策略,转染293T和HepG2细胞,收转染后指定时间点的培养上清,检测FⅧ的活性(APTT法)及转染上清中FⅧ的抗原表达量(ELISA及Western blot法)。质粒高压注射HA小鼠,取高压注射后指定时间点小鼠外周血血浆样本,进行FⅧ的活性和抗原表达量检测。将ApoE-hAAT promoter携带的hHC、hLC、rHC、rLC分别包装、纯化AAV病毒,按HC:LC=1:1的比例,分为高剂量组(2×10~(13)vg/kg)和中剂量组(8×10~(12)vg/kg),尾静脉注射HA小鼠,每两周采集外周血监测FⅧ在HA小鼠体内的长期表达效果,并评价AAV载体介导的HA基因治疗的安全性。研究结果:我们通过体内外研究发现,rFⅧ活性高于hFⅧ活性。并且,体外细胞转染结果显示,rLC联合hHC能够提高FⅧ的活性,而对FⅧ抗原表达量的影响不大,提高FⅧ比活性约4-5倍;rLC联合hHC提高FⅧ的活性,可排除通过提高转染上清中FⅧ的热稳定性实现,考虑主要受rLC分子本身性质的影响。在体内,HA小鼠高压注射结果显示,rLC能够提高FⅧ的活性和比活性,其比活性提高约4.5倍;AAV病毒携带的hHC、hLC、rLC注入HA小鼠体内,无论是中剂量组还是高剂量组,rLC均能够提高FⅧ的活性,尤其在高剂量组,hHC+rLC与hHC+hLC活性总体具有显著的统计学差异,AAV介导的FⅧ均能够在HA小鼠体内长期表达至36周,且小鼠肝脏功能基本保持正常,在高剂量组有一只小鼠有抑制物产生。研究结论:体内外研究结果提示,rFⅧ活性高于hFⅧ;rLC联合hHC能够提高FⅧ的活性、比活性;AAV介导的FⅧ基因治疗HA小鼠,可使小鼠体内FⅧ长期维持在治疗水平,且总体上,hHC+rLC活性高于hHC+hLC活性;并且rLC与hLC氨基酸序列差异,在提高FⅧ活性、比活性中起主要作用。该研究为AAV介导的HA的基因治疗及构建有着较高表达效率的FⅧ表达元件提供了基础研究数据,也为构建能提高hFⅧ活性的新型FⅧ序列提供了新的选择。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R554.1
【图文】：

上海交通大学硕士学位论文Ⅸ,FⅨ)基因被克隆成功，血友病的基因治疗就被作为一个长期的目标，也一直是国际血友病治疗研究的热点[14]。直到 2011 年 Nathwani 等[15]发表了在英国开展的一项HB 基因治疗的临床研究，该项研究获得了理想的疗效，这项有里程碑意义的研究极大地鼓舞了国际血友病基因治疗研究学者探索 HA 基因治疗的热情。基因治疗不仅可以克服传统替代疗法的弊端，而且可以维持合适的载体介导的转基因 FⅧ在体内持久、高效的表达，为 HA 患者的治愈带来希望。

上海交通大学硕士学位论文AAV 载体能够转导许多组织，实现基因的稳定表达并且具有较低的免疫原性[26]。临床实验研究证实，AAV 是理想的能够实现基因递送到分裂后细胞和组织的载体[26]。AAV 载体是血友病基因治疗中备受关注的载体[27]。与 HB 缺乏的 FⅨ不同，FⅧ cDNA 片段较大，FⅧ cDNA 约 7.0kb，远远超过了 AAV 载体的包装容量（4.7kb）限制，难以实现高效的包装和表达，限制了 HA基因治疗的发展[28]。成熟的 FⅧ蛋白由 6 个结构域组成，包括 3 个同源的 A 区，2个同源的 C 区和 1 个 B 区按照 A1（a1）-A2（a2）-B（a3）-A3-C1-C2 顺序构成含2332 个氨基酸的高分子量蛋白,去除 B 结构域的 FⅧ（FⅧ-BDD）对 FⅧ的活性没有影响[29]。FⅧ蛋白在水解活化过程中，可产生包括由 A1-A2-B 结构域组成的重链（Heavy chain, HC）以及 A3-C1-C2 结构域组成的轻链（Light chin,LC）构成的异二聚体（Heterodimer）[30]，并进一步水解活化成有活性的片段，发挥止血功能。

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