KCNJ5基因突变对人肾上腺皮质腺癌H295R细胞分泌醛固酮的影响

发布时间：2020-07-04 16:59

【摘要】：目的:应用脂质体LipofectamineTM3000转染技术,探讨突变型KCNJ5 G151R、del I157基因对人肾上腺皮质腺癌H295R细胞分泌醛固酮的影响。方法:构建野生型KCNJ5、突变型KCNJ5 G151R、突变型KCNJ5 del I157和空载体质粒,采用脂质体LipofectamineTM3000转染方法转染H295R细胞,将其分为野生型KCNJ5组、突变型KCNJ5G151R组、突变型KCNJ5 del I157组和对照组。将质粒脂质体复合物转染H295R细胞后,更换为含和不含100n M(nmol/L)血管紧张素Ⅱ的培养基,以及含和不含10u M(umol/L)维拉帕米的培养基,置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养36小时。采用Di SBAC2荧光染料检测各组细胞膜电位变化;使用蛋白质免疫印迹(Western blot)方法检测各组细胞KCNJ5蛋白表达水平;应用放射免疫技术检测各组细胞上清液中醛固酮浓度;实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR)技术检测细胞中11-β羟化酶(CYP11B1)、醛固酮合酶(CYP11B2)基因的表达水平。结果:(1)与对照组相比,两组转染KCNJ5 G151R、KCNJ5 del I157的H295R细胞质内荧光增强,差异有统计学意义(P0.05)。(2)KCNJ5蛋白在转染空载体质粒、野生型KCNJ5、突变型KCNJ5 G151R、突变型KCNJ5 del I157的H295R细胞中平均表达量为1.08±0.04、1.64±0.07、1.82±0.04、1.87±0.05。采用t检验将各实验组分别与对照组相比,野生型KCNJ5组、突变型KCNJ5 G151R组、突变型KCNJ5 del I157组KCNJ5蛋白表达均明显高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。突变型KCNJ5 G151R组与KCNJ5 del I157组比较,差异不显著(P0.05)。(3)使用放射免疫分析法检测上清液中醛固酮浓度,突变型KCNJ5 G151R组是对照组的2.86倍(1.720±0.045vs0.600±0.039ng/ml,P0.05),突变型KCNJ5 del I157组是对照组的2.26倍(1.356±0.036vs0.600±0.039ng/ml,P0.05),而野生型KCNJ5组与对照组差异不显著(0.636±0.053vs0.600±0.039ng/ml,P0.05)。(4)CYP11B1 mRNA在对照组、野生型KCNJ5组、突变型KCNJ5 G151R组、突变型KCNJ5 del I157组细胞中表达量为1±0.439、1.244±0.774、4.404±0.820、3.089±0.691。采用t检验将各组与对照组相比,突变型KCNJ5 G151R组、突变型KCNJ5del I157组H295R细胞中CYP11B1 mRNA表达明显高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。野生型KCNJ5组与对照组比较,差异不显著(P0.05)。(5)CYP11B2 mRNA在对照组、野生型KCNJ5组、突变型KCNJ5 G151R组、突变型KCNJ5 del I157组H295R细胞中表达量为1±0.106、1.302±0.275、2.644±0.063、1.736±0.269。采用t检验将各组与对照组相比,突变型KCNJ5 G151R组、突变型KCNJ5del I157组H295R细胞CYP11B2 mRNA表达明显高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。野生型KCNJ5组与对照组比较,差异不显著(P0.05)。(6)血管紧张素Ⅱ刺激后,转染突变型KCNJ5 G151R的H295R细胞分泌醛固酮升高1.39倍(2.381±0.051vs1.704±0.045ng/ml,P0.05),转染突变型KCNJ5 del1I57对的H295R细胞分泌醛固酮升高1.67倍(2.263±0.042vs1.349±0.046ng/ml,P0.05)。转染突变型KCNJ5 G151R的H295R细胞中CYP11B1 mRNA表达量增加(1.000±0.036 vs 1.466±0.161,P0.05),转染突变型KCNJ5 G151R的H295R细胞中CYP11B2 mRNA表达量增加(1.000±0.066 vs 1.806±0.166,P0.05),转染突变型KCNJ5 del I157的H295R细胞中CYP11B1 mRNA表达量增加(0.796±0.104 vs 1.576±0.064,P0.05),转染突变型KCNJ5 del I157的H295R细胞中CYP11B2 mRNA表达量增加(0.867±0.073 vs 2.116±0.052,P0.05)。(7)维拉帕米干预后,使转染突变型KCNJ5 G151R的H295R细胞分泌醛固酮水平下降37.9%(1.720±0.045vs1.068±0.034ng/ml,P0.05),转染突变型KCNJ5 del I157的H295R细胞分泌醛固酮水平下降26.8%(1.356±0.036ng/mlvs0.992±0.046,P0.05)。转染突变型KCNJ5 G151R的H295R细胞中CYP11B1 mRNA表达量降低(4.044±1.020 vs 2.455±0.574,P0.05),转染突变型KCNJ5 G151R的H295R细胞中CYP11B2 mRNA表达量降低(2.664±0.527 vs 1.266±0.401,P0.05)。转染突变型KCNJ5 del I157的H295R细胞中CYP11B1mRNA表达量降低(8.053±1.038 vs 3.089±0.691,P0.05),转染突变型KCNJ5 del I157的H295R细胞中CYP11B2 mRNA表达量降低(2.623±0.313 vs 1.736±0.469,P0.05)。结论:(1)突变型KCNJ5G151R和KCNJ5 del I157可能通过使H295R细胞膜电位发生去极化,使醛固酮合酶基因CYP11B2表达水平增加,导致H295R细胞分泌的醛固酮增多。(2)血管紧张素Ⅱ刺激后,转染突变型KCNJ5 G151R和KCNJ5del I157的H295R细胞中CYP11B2 mRNA的表达及醛固酮分泌量增加。(3)维拉帕米干预后,转染突变型KCNJ5 G151R和KCNJ5 del I157的H295R细胞中CYP11B2 mRNA的表达及醛固酮分泌量下降。
【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R736.6
【图文】：

西 南 医 科 大 学 硕 士 学 位 论 文结 果、人肾上腺皮质腺癌 NCI-H295R 细胞培养购买的人肾上腺皮质腺癌 NCI-H295R 细胞，使用含 2%Ultroser 培养基能培养成功，在倒置显微镜下见 NCI-H295R 细胞贴壁生长，态良好，轮廓清晰，呈多角形,两极有轴突样长凸起，细胞间成网结构（如图 1）。

图 2：按 Lipofectamine 3000 质粒转染手册分组转染 36h 后，荧光显微镜下各组细胞荧光表达情况。3、KCNJ5 基因对 H295R 细胞 KCNJ5 蛋白表达影响将空载体质粒（A 组）、野生型 KCNJ5（B 组）、突变型 KCNJ5G151R（C 组）和突变型 KCNJ5 del157I（D 组）转入 H295R 细胞，于 37℃、5%CO2细胞培养箱中培养 36 小时后，使用蛋白质免疫印迹（Western Blot ）检测各组细胞中 KCNJ5 蛋白表达情况（如图 3、4），KCNJ5 蛋白分别在各组中的平均表达量为 A 组：1.08±0.04，B 组：1.64±0.07，C 组：1.82±0.04，D 组：1.87±0.05。与对照组相比，两个独立样本间比较，转染野生型 KCNJ5 组、突变型 KCNJ5 G151R组、突变型 KCNJ5 delI157 组 KCNJ5 蛋白表达明显高于对照组，差

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本文编号：2741344