糙皮侧耳转录组测序、木质素降解关键基因及基因克隆

发布时间：2020-07-04 19:20

【摘要】：本研究通过对木本基质下培养的糙皮侧耳7株不同菌株进行降解木质素的高效菌株进行筛选,对筛选出来的糙皮侧耳菌株采用Illumina HiSeq 4000 SBS高通量测序平台进行转录组测序,挖掘糙皮侧耳降解木质基质的候选基因,通过比对到NR、Swissprot、KEGG、String、Pfam等数据库中得到差异基因相关信息,再通过GO富集分析、pathway富集分析,得到与降解木质素、纤维素相关的候选基因以及相关的主要代谢通路。再对与木质素降解相关的候选基因中挑选出3个过氧化物酶基因c30793-g1、c28624_g1、c31898_g1,利用基因工程手段对3个过氧化物酶基因进行克隆以及异源表达载体的构建,主要研究结果如下:1、对糙皮侧耳四季大白、平菇1号、平菇2号、pL109、pL206、pL305、pL539这7株菌株进行了定性筛选和定量筛选,通过变色圈实验来实现对菌株的定性,实验结果表明7株菌株均有降解木质素的能力,根据菌落直径与变色圈直径比值d1/d2以及生长状况筛选出四季大白与PL305降解木质素的能力较强。定量筛选通过计算木质素降解率和综纤维素降解率以及SF值,SF值0.91为平菇1号和PL206,SF值0.83为四季大白。木质素降解率最高的为四季大白14.87%,,综纤维素降解率最低为PL109为7.80%。综上筛选出四季大白是本次实验的高效菌株。2、转录组测序共得到有效数据共78.47Gb,糙皮侧耳转录本序列64228条,单基因序列共46417条。使用BLast工具将转录本序列比对到NR、Swissprot、KEGG、String、Pfam等数据库中,共有33736条序列得到注释。得到1408条差异表达基因,其中有1183条基因为上调,通过GO富集分析得到,差异基因显著富集于木质素分解代谢过程、锰过氧化物酶活性、苯丙素分解代谢过程中。将差异基因比对到KEGG数据库中,共有313条得到注释的序列并对其进行pathway富集分析,得到差异基因显著富集于氨基苯甲酸降解过程、色氨酸代谢、β-丙氨酸代谢、等通路中。其中c27028_g1、c28624_g1、c30793_g1、c30849_g1等基因与木质素降解过程相关性较高。c24893_g1、c29559_g1、c29956_g2等基因与纤维素降解的过程相关性较高。转录组数据分析结果筛选出来的与木质素降解相关的候选关键基因中,挑选出c31898_g1、c28624_g1、c30793-g1三个过氧化物酶基因,利用RT-PCR技术对这3个基因进行了克隆,成功克隆3个基因后,进行PMD-19T载体的连接,得到了c30793-PlxMD19-T、c28624-PMD19-T、c31898-PMD19-T 三个重组载体,c30793-PMD19-T、c28624-PMD19-T、c31898-PMD19-T三个重组载体与目的载体pGAPZαA进行双酶切,酶切后进行连接,成功构建3个重组表达载体c28624-pGAPZαA、c31898-pGAPZαA、c30793-pGAPZαA。
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S646.14
【图文】：

图２－１邋７株菌株的变色圈逡逑表２－２变色圈直径、菌落直径菌落直径（ｄｌ）邋ｃｍ逦变色圈直径（ｄ２）邋ｃｍ邋ｄｌ／ｄ２逡逑５＾８逦＇逦４＾８逦Ｖ２＼逡逑６．６逦５．１逦１．２９逡逑５．３逦２．２逦２．４１逡逑５．５逦３．１逦１．７７逡逑７．４逦６．１逦１．２１逡逑６．８逦５．３逦１．２８逡逑＾６逦４＾逦Ｌ２１选的结果与分析逡逑解木质素和综纤维素的降解率进行了计算，从表中可看出木为四季大白，其次为ＰＬ３０５，降解率分别为１２．３７％、１０．３０降解率也为最高，分别为１４．８７％、１３．４０％。木质素降解率解率为７．８０％，对综纤维素降解率较低的菌株有ＰＬ２０６和平１０．８０％逡逑表２－３木粉纤维素降解数据办二亩■培养前综纤培养前综纤培养后综纤逡逑

图３－１邋ＲＮＡ电泳图逡逑组测序数据与组装结果统计逡逑种不同培养基质样品，木本培养基（ＰＯ＿Ｗ）、ＰＤ培养基（ＰＯ＿Ｃ进行测序。对测序结果的分析表明（表３－４），有效数据共７８．４７Ｑ２０碱基百分比均不小于９８．７０％，邋Ｑ３０碱基百分比均不小于９５．９效，能够进行统计分析。逡逑结果进行统计（表３－５），得到６４２２８条序列重叠群组装转录本序，Ｎ５０长３７３４邋ｂｐ。得到４６４１７条转录本序列组装单基因序列，序１ｂｐ，邋Ｎ５０长２８５９邋ｂｐ，单基因序列的平均长度主要为１？１０００邋ｂｐ度大于邋１０００邋ｂｐ邋的有邋８１９４邋条，占邋１７．６５％。逡逑数据提交到ＮＣＢＩ中，ＳＲＡ登陆号：ＳＲＰ１０７８２４。逡逑表３－４样品有效数据评估读数逦碱基逦错误率／％逦Ｑ２０／％逦Ｑ３０／％５８６４００８６逦８７６０７６８７２８逦ＯＭＵ逦９８．７８逦９６Ｔ７５４０７３５４２逦８０７３５１０７１７逦０．０１１３逦９８．７３逦９６．０６

【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 王威;丑天胜;刘芳;严俊杰;吴塔菊;李少杰;谢宝贵;;金针菇单、双核菌丝差异表达基因分析[J];菌物学报;2015年04期

2 刘芳;王威;谢宝贵;;金针菇菌丝与原基差异表达基因分析[J];食用菌学报;2014年01期

3 肖翔;官春云;尹明智;李h;官梅;;基因芯片技术在农业中应用的研究进展[J];中国农学通报;2012年33期

4 祁云霞;刘永斌;荣威恒;;转录组研究新技术:RNA-Seq及其应用[J];遗传;2011年11期

5 申进文;徐柯;麻兵继;王震;庄庆利;关园园;张彪;张玉亭;;伏牛山大型真菌资源(Ⅲ)[J];食用菌;2010年02期

6 高千千;朱启忠;;漆酶-介体体系(LMS)及其应用[J];环境工程;2009年S1期

7 邓勋;宋瑞清;闵凯;宋小双;孙海珍;;高效选择性降解稻草木质素的菌株及其产酶特性的研究[J];吉林农业大学学报;2009年04期

8 王大力;黄大鹏;;基因表达系列分析技术研究进展[J];动物医学进展;2009年04期

9 蔡为明;李南羿;谢鸣;高中山;金群力;;利用mRNA差异显示技术研究香菇发育相关基因[J];菌物学报;2009年02期

10 张力;韩大勇;邵喜霞;;白腐真菌木质素降解酶系研究进展[J];中国牧业通讯;2008年23期

相关博士学位论文 前1条

1 吴元龙;陆地棉隐性核不育系1355A败育机制转录组学与蛋白质组学研究[D];华中农业大学;2016年

相关硕士学位论文 前4条

1 耿丽丽;基于RNA-Seq技术的栽培和野生番茄转录组分析[D];浙江理工大学;2017年

2 王年久;mRNA差异显示技术研究糙皮侧耳菌丝体及子实体差异表达基因[D];华中农业大学;2007年

3 杜海萍;几种真菌对稻草生物降解的研究[D];东北林业大学;2006年

4 程道军;家蚕大规模EST测序及脂肪体基因表达谱分析[D];西南农业大学;2003年

本文编号：2741479