拟南芥糖基转移酶基因UGT86A1参与植物对非生物胁迫耐性的作用研究

发布时间：2020-07-05 16:13

【摘要】：在不利环境下,植物体能够迅速感知并发生一系列的生理生化反应,包括体内生理代谢改变、激素等物质含量发生变化、抗逆相关基因表达量改变等等。糖基转移酶是专门负责糖基化修饰的一类酶。植物分子被糖基化后能够改变分子的水溶性以及生物活性,进而对植物的生理活动产生影响。根据公开发表的基因芯片数据得知,拟南芥糖基转移酶基因UGT86A1的表达能够对非生物胁迫做出响应。暗示该基因可能参与植物对非生物胁迫的适应性调节。为了明确糖基转移酶基因UGT86A1在植物应对逆境胁迫中的作用,开展了本课题研究。首先对野生型拟南芥进行了 NaCl和Mannitol的胁迫处理,并用qPCR技术检测了UGT86A1在胁迫处理后的表达水平。结果发现,UGT86A1受非生物胁迫诱导表达上调。然后,构建了UGT86A1的CRISPR/Cas9敲除载体、过表达载体、GUS报告载体以及原核表达载体,并通过转基因技术成功获得了UGT86A1的敲除株系、过表达株系、GUS转基因株系以及原核表达菌株。UGt86A1启动子:GUS转基因株系在经过NaCl和Mannitol处理以后,GUS染色较对照明显加深,进一步证明了UGT86A1受非生物胁迫诱导表达。通过对UGT86A1敲除株系和过表达株系一系列的逆境适应性分析,发现在NaCl和Mannitol的逆境处理下,与野生型相比,UGT86A1敲除株系无论是在种子萌发、子叶转绿还是在主根伸长等方面都表现出对逆境敏感的表型。与此相反,UGT86A1的过表达株系都表现出对逆境耐性增强的表型。在土壤培养条件下,同样进行了耐盐和耐旱实验。实验结果表明,UGT86A1敲除株系在盐和干旱处理条件下都比野生型的存活率低,而过表达株系都比野生型的存活率高。这些结果说明了UGT86A1无论是在植物萌发期还是在苗期都参与了植物对逆境的适应性调节,能够增强植物的耐逆性。为了探索UGT86A1在植物应对逆境胁迫中的作用机制,测定了UGT86A1敲除体和过表达体在逆境条件下的生理学变化。首先统计了UGT86A 敲除系和过表达系的离体叶片失水率,并观察了叶片在干旱条件下的气孔开度。发现UGT86A1敲除株系的离体叶片失水率高,而UGT86AI过表达株系离体叶片失水率相对较低。与之相一致,发现在干旱条件下,敲除株系气孔开度较大,而过表达株系气孔开度较小。这表明UGT86A1的生理学功能可能与气孔运动有某种联系,它的功能丧失导致在干旱条件下叶片失水较快。进一步测定了 UGT86A1敲除体和过表达体在逆境环境下与耐逆相关的其他一些生理学变化。结果发现,在UGT86A1敲除体中,可溶性糖的含量比野生型低,而丙二醛的含量比野生型高。而在UGT86A1过表达体中,可溶性糖的含量比野生型高,丙二醛的含量比野生型低。通过盐处理和干旱条件下的总抗氧化能力测定以及叶片细胞学染色技术,发现UGT86A1敲除体的清除活性氧的能力低于野生型,过表达体清除活性氧的能力高于野生型。这些实验数据说明UGT86A1的作用可能还涉及到渗透保护、膜的稳定性以及活性氧清除等方面。最后检测了UGT86A 敲除体和UGT86A1过表达体在逆境条件下抗逆相关基因表达量的变化,包括DREB2A、RD29B、AIL1、RD22、COC47和CAT1等。发现这些抗逆相关基因在UGT86A1敲除体中的表达普遍下调,而在过表达体中表达上调。我们推测,UGT86A1之所以能够引起以上多种生理学指标的变化,可能与这些耐逆相关基因的表达变化有关系。本研究曾试图从糖基转移酶的底物入手进一步挖掘UGT86A1发挥作用的分子机制,但由于酶蛋白表达和纯化的困难,目前在底物鉴定方面还没有获得进展。总之,通过对UGT86A1突变体和过表达体的一系列研究,明确了糖基转移酶基因UGT86A1在增强植物对非生物胁迫的适应性反应中发挥着重要的作用。同时,初步发现UUGT86A1基因在逆境环境下可能通过影响抗逆相关基因的表达,进而对植物抗逆的的生理学过程产生影响。糖基转移酶UGT86A1的底物鉴定以及UGT86AI发挥作用的深层分子机理,还需要进一步研究。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2
【图文】：

糖基化,代谢产物,细胞分裂素,拟南芥

１．２．２调节植物激素平衡逡逑植物激素是一种天然条件下所产生的有机物质，其浓度的高低会影响植物的逡逑生理过程，包括影响植物的生长、分化和发育，也包括影响气孔运动等其他生理逡逑过程（Ａｃｈａｒｄ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００６；邋Ｄａｖｉｅｓ，邋２０１０）。逡逑Ｈｏｕ等（２００４）通过体外生化实验鉴定了拟南芥糖基转移酶ＵＧＴ７６Ｃ１能够逡逑糖基化细胞分裂素，并且在对ｔ／Ｇ７７（５Ｃ７突变体外源添加细胞分裂素后，突变体逡逑植株表现为主根更长，叶绿素增多和花青素积累增加。这说明Ｃ／Ｇ７７６Ｃ／能够调逡逑节植物体内细胞分裂素含量的平衡并可能间接维持了其他小分子物质含量的平逡逑衡。拟南芥ＵＧＴ７６Ｃ１氧化的是细胞分裂素的Ｎ位，拟南芥ＵＧＴ７３Ｃ１、ＵＧＴ７３Ｃ５、逡逑ＵＧＴ８５Ａ１还能够糖基化细胞分裂素的ＯＨ位（Ｈｏｕ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００４）。Ｌｉｕ等（２０１５）逡逑分析鉴定了拟南芥ＵＧＴ７１Ｃ５通过对脱落酸（ＡＢＡ）的糖基化修饰调节了植物体逡逑１２逡逑

响应机制,棉子糖,糖基转移酶,寡糖

山东大学硕士学位论文逡逑ａｌ．，邋２０１４）。微阵列和ＲＮＡ凝胶检测分析表明，ＤＲＥＢ２Ａ调节了许多与渗透胁迫逡逑相关基因的表达。细胞核中位于ＤＲＥＢ２Ａ的１３６和１６５位点间的残基对蛋白质逡逑的稳定性起着重要作用，这也对蛋白质的激活产生影响（Ｓａｋｕｍａ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００６ａ；逡逑Ｓａｋｕｍａｅｔａｌ．，２００６ｂ）。这表明了在非生物胁迫条件下，植物体抗逆性能的改变，逡逑其体内的转录因子ＤＲＥＢ２Ａ的表达也应当发生相应变化（Ｓａｋｕｍａ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００６；逡逑Ｋｉｍ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１１；邋Ｋｉｍ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１２）。逡逑

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