肾小管上皮细胞HK2中LL-37的表达情况及相关基因敲除细胞系的初步建立

发布时间：2020-07-05 17:49

【摘要】：[目的]检测肾小管上皮细胞HK2在感染状态下细胞中抗菌肽LL-37的表达情况,探讨LL-37与肾脏感染的关系,同时初步建立LL-37基因敲除的HK2细胞系。[方法]在体外将不同浓度的LPS(0、0.1、1、10ug/ml)作用于肾小管上皮细胞HK2,其中Oug/mlLPS组作为对照组,0.1、1、1Oug/mlLPS组设为实验组。LPS刺激12h后,分别采用RT-PCR和western blot检测HK2细胞中LL-37mRNA和蛋白的表达水平,并通过ELISA法检测细胞培养上清液中LL-37蛋白的相应浓度。同时,采用CRISPR/Cas9系统对HK2细胞的LL-37基因进行敲除,后期通过流式细胞仪、嘌呤霉素及单克隆挑取等方法筛选稳定株,最后利用western blot对基因敲除的稳定株进行初步鉴定。[结果]RT-PCR相对定量结果显示除了 0.1ug/ml组外,实验组中LL-37mRNA的表达水平均明显高于对照组;western blot检测发现实验组HK2细胞中LL-37蛋白的表达均高于对照组;ELISA结果表明1、10ug/ml的LPS可刺激HK2细胞分泌LL-37蛋白;以上三种检测结果均提示LPS对LL-37的表达呈现一定的剂量依赖性。同时,LL37-KO和LL37-HDR两质粒对HK2细胞的转染效率较高,且与正常HK2细胞相比,对基因敲除细胞株行WB检测未见LL-37蛋白的表达。[结论]未感染状态下的肾小管上皮细胞HK2中抗菌肽LL-37的表达很少,而适宜浓度的LPS则可促进HK2细胞LL-37mRNA及蛋白的表达,并呈现一定的剂量依赖性,提示LL-37可能在肾小管上皮细胞发生感染时发挥一定的作用,参与肾脏感染的免疫应答。同时,WB结果表明本实验中HK2细胞LL-37基因敲除的效果较理想。
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R692
【图文】：

溶解曲线,图谱,细胞,电泳缓冲液

１．邋ＲＴ－ＰＣＲ法检测不同浓度ＬＰＳ刺激ＨＫ２细胞后ＬＬ－３７ｍＲＮＡ的表达情况逡逑１．１逦ＲＮＡ电泳结果采用Ｔｒｉｚｏｌ法提取各组细胞的总ＲＮＡ后，进行电泳检测逡逑（１．５％琼脂糖，ｌｘＴＡＥ电泳缓冲液），由图１可见２８ＳｒＲＮＡ的亮度是１８ＳｒＲＮＡ逡逑的２倍左右，表明所提取的ＲＮＡ无降解，质量高。逡逑｜５ＳＳ｜；ｉｏｏｏ逡逑—８００逦ｍｉ逡逑－．＾邋（＞00邋Ｉ逡逑图１各组细胞总ＲＮＡ电泳检测图谱（注：左边的Ｍａｒｋｅｒ为ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ，逡逑其只为检测基因组污染，并不代表ＲＮＡ实际条带的大小）逡逑１．２邋ＰＣＲ溶解曲线将逆转录合成的ｃＤＮＡ行ＰＣＲ反应，发现各组目的基因逡逑ＬＬ－３７和内参基因ＧＡＰＤＨ的溶解曲线均为单一波峰，没有其余杂峰出现，表明逡逑所得到的产物特异性高，无引物二聚体和非特异性条带的形成。（图２、图３）逡逑２０逡逑

溶解曲线,引物二聚体,内参,逆转录

１．２邋ＰＣＲ溶解曲线将逆转录合成的ｃＤＮＡ行ＰＣＲ反应，发现各组目的基因逡逑ＬＬ－３７和内参基因ＧＡＰＤＨ的溶解曲线均为单一波峰，没有其余杂峰出现，表明逡逑所得到的产物特异性高，无引物二聚体和非特异性条带的形成。（图２、图３）逡逑２０逡逑

【参考文献】