水稻穗顶退化突变体paa1019和paa74的基因克隆与功能分析

发布时间：2020-07-06 20:55

【摘要】：水稻穗部颖花的正常发育是产量形成的基础,生产上常见的穗顶颖花退化往往造成产量损失,该性状大多受数量性状基因控制,并与异常气候变化密切相关,其分子机制尚未明确。本研究中,我们从籼稻保持系骨干亲本宜香1B构建的EMS突变体库中筛选获得两份穗顶部退化突变体,命名为paa1019和paa74,两份突变体穗顶退化程度不同。通过基因定位,我们成功分离到候选基因,并对其功能进行了验证和分析。具体研究结果如下:1.对paa1019和paa74进行了详细的表型鉴定,发现穗顶颖花退化与H_2O_2大量积累以及细胞程序性死亡有关。2.paa1019和paa74穗部颖花退化的时空分布特征非常相似,即枝梗原基和幼穗顶端颖花原基分化正常,顶端颖花退化起始于幼穗伸长和颖花分化过程中,即穗轴枝梗快速伸长期(幼穗长约4-10cm),其颖花生长发育受阻;退化颖花在穗上具有从上到下逐渐减弱的趋势,其分布具有类似‘顶端优势’特点,可能与穗部生长素积累水平有关。3.石蜡切片观察孕穗期和抽穗期的退化颖花与正常颖花,发现颖花退化的出现会伴随有花器官发育受损,内外稃及花药发育畸形直至彻底坏死萎缩,无花粉或花粉不育。paa74的退化颖花发育畸形的情况比同时期的paa1019略轻。4.遗传分析表明,paa1019和paa74的突变性状均由单隐性核基因控制。通过基因定位并结合全基因组重测序方法,对于paa1019,我们在基因OsCIPK31(LOC_Os03g20380)序列中鉴定出其碱基突变导致剪切方式发生改变,致使第二外显子序列缺失;而对于paa74,发现OsALMT7(LOC_Os02g45160)编码区发生碱基替换,即由G突变为A,导致对应编码氨基酸由精氨酸变为赖氨酸。通过CRISPR/CAS9基因敲除和互补试验,证实OsCIPK31和OsALMT7分别为突变体paa1019和paa74的目的基因。5.CIPK31属于钙诱导磷酸酶蛋白激酶家族,参与逆境胁迫的钙信号途径。为了探究paa1019对外界环境的响应,对paa1019苗期分别进行了低温、盐分以及干旱的非生物胁迫处理和稻瘟病菌生物胁迫处理,发现CIPK31对温度、水分、盐分以及病原菌具有高度敏感性,其中对温度和盐分的胁迫响应是正向调控而对干旱响应很可能是负向的。ALMT7属于铝诱导的有机酸通道蛋白,目前水稻中关于ALMTs的报道很少。我们对paa74进行了铝盐处理,发现处理后的突变体与野生型表型无差异。6.OsCIPK31定位在细胞胞质中,在水稻全生育期的各组织部位均有表达,其中,在根部高表达,尤其是幼根表达量最高,而在穗发育过程中呈现出相对低的表达。尽管如此,OsCIPK31在穗退化起始节点(幼穗长约为4cm)比其他穗发育时期具有较高的表达,且原位杂交也表明其在颖花中高表达。OsALMT7在根、茎、叶、穗等组织均有表达,在幼根和成熟根表达量最高,这与其受铝活化苹果酸盐运输蛋白的功能相符合,原位杂交结果也证实ALMT7在颖花高表达。7.对转录组进行初步分析,GO和KEGG富集分析将paa1019有关差异基因富集到MAPK通路和植物激素信号转导通路。paa74则主要与DNA复制、细胞分裂等生物过程相关,同时质膜运输、ROS水平等途径也很可能参与其中。酵母双杂试验表明CIPK31和ALMT7无直接互作反应,而paa1019:paa74双突变体穗顶退化表型无叠加趋势。同时,OsCIPK31和OsALMT7分别在paa74和paa1019中的表达水平与在野生型中的表达水平差异不大。进一步地,在穗起始退化过程中,转录组的数据分析表明,两份突变体材料均富集到了相似的调控通路。推测二者在穗部颖花发育调控方面属于同一条通路的上下游关系。
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S511
【图文】：

示意图,拟南芥,生长发育,细胞分裂

1.6.1 MAPK 调控植物的生长发育植物生长发育许多生理过程如细胞分裂、器官发育以及衰老退化等都需要 MAPK级联系统的参与[85]（图 1）。如在烟草体内细胞分裂后期，受体 NACK1/NACK2 能接收细胞分裂信号并且激活 NPK1-NQK1-NRK1 级联系统介导细胞板的形成，从而调控细胞分裂过程[86]。同样在拟南芥中同源的途径 ANP1/2/3-MKK6-MPK4 级联激活下游底物 MAP65-1 从而调控成膜体的赤道板形成而影响细胞分裂[85, 87]。另外，在拟南芥还存在 YODA-MKK4/5-MPK3/6 级联反应能够负调控下游的转录因子 SPCH 来达到调节气孔细胞发育[88, 89]，还可以响应上游的 ER 信号后调控花梗细胞分裂和增殖，导致花序形状和花梗长度改变[85, 90]。MAPK 级联系统还参与多个生殖过程，如AtMPK4[91]参与调控花粉发育，其功能缺失突变体表现出花粉发育缺陷；mpk3/mpk6突变体不能完成正常双受精过程[92, 93]。

生理响应,乙烯合成,穗部,茉莉素

胁迫介导的 ROS 积累引发生理响应[117]。不同的非生物胁迫刺激直接/间接诱下游各种信号传导机制调节 ROS 的浓度，引起各种生理反应。erview of the central role of ROS in the responses towards abiotic stressfactors. D either directly or indirectly (through the action of other signals and hormones) lef ROS.K 级联信号系统与多种 PCD 的调控路径协同、交叉抑制或反馈调节133]。如 MKK5-MPK3/MPK6 级联通过对乙烯合成途径中的关键酶 A控影响乙烯合成继而介导 PCD，此外 MAPK 级联信号调控乙烯信号目的[134-136]；MAPK 还可以与 ROS 协同调控 PCD，二者可形成反馈尤其是 MAPK 通过调控 ROS 含量介导 PCD[137, 138]。激素对水稻颖花发育调控也被认为是影响穗部发育的关键因素之一[139, 140]。穗部枝梗的发育易如生长素、赤霉素、细胞分裂素、茉莉素等与外界环境因素的共同作

示意图,聚类,模块,外界作用

因模块聚类示意图drogram of gene clusters达模块与外界作用的关联征基因与外界作用因素的相关性。我们提取了每一个模块的特征们与外界作用的关联状况，并将得到的相关系数绘制成热图。颜色高。界作用因素的基因显著性。对每个模块中所有基因的 GS 绝对值进块内基因表达情况与外界作用的总体关联状况。基因模块深入分析块基因功能富集。针对每组数据的基因模块，进行 GO 和 KEGG些生物学功能和代谢通路与这些基因模块显著关联（表 3）。富集到大排列。表 3. 重要相关性状统计及编号Table 3. The related traits statistics and corresponding numbers

【相似文献】