甘蓝型油菜LEA与VOC基因家族的鉴定及其在抗逆性和含油量形成中作用机制研究

发布时间：2020-07-07 11:40

【摘要】：甘蓝型油菜(Brassica napus)是世界上主要的油料作物之一。相比于其他油料作物,其种植面积广泛且产油效率较高。但是,我国甘蓝型油菜的生产还面临着品种之间品质差异大,产油量受环境影响大的挑战。因此,培育和研究高含油量,以及抗逆的油菜品种具有重要的意义。在本课题组前期对高含油量和低含油量甘蓝型油菜的蛋白质组学和比较基因组学研究中发现,LEA(late embryogenesis abundant)蛋白和VOC(vicinal oxygen chelate)蛋白在高含油量的油菜种子大量存在,说明它们可能对油菜的油脂积累有一定的作用。其中,LEA是高等植物胚胎发育晚期大量积累的一类蛋白,主要在植物抗非生物胁迫中发挥作用。VOC基因属于邻氧螯合金属酶超家族,参与催化多种生物学反应。虽然LEA和VOC基因家族在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中有相关鉴定工作,但是在甘蓝型油菜中的全基因水平鉴定尚未报道,并且目前缺乏对其在非生物胁迫以及油脂合成代谢方面的相关研究。本研究针对此两个基因家族,结合生物信息学,分子生物学,以及转录组学分析,在甘蓝型油菜全基因组水平鉴定了此两个基因家族,并对其在干旱胁迫响应,油脂合成方面发挥的功能、作用机理进行研究,取得的主要研究成果如下:(1)本研究首先通过生物信息学手段,在甘蓝型油菜全基因组水平对LEA基因家族进行鉴定,共鉴定出108个BnLEA基因,分为8个亚家族。对此基因家族成员的结构比对发现其存在内含子少,含有5-10个motif的结构特点。共线性和进化分析表明,接近三分之二的BnLEA与片段化复制事件相关。LEA基因在甘蓝型油菜基因组中扩张和成簇主要是由于祖先基因的全基因组复制(WGD),最后伴随着随机复制事件与片段化复制事件而形成。采用实时荧光定量的方法(qRT-PCR)对甘蓝型油菜不同组织的LEA基因表达量进行探究,结果表明不同的亚家族表现出不同的表达模式,而系统进化成对的基因表现出类似的表达模式,大部分BnLEA基因在晚期发育的果荚(播种四十周后)和叶片中的存在较高的表达量。(2)利用拟南芥的同源基因,在甘蓝型油菜数据库中,鉴定出VOC家族成员38个,其中,分为乙二醛酶I亚家族(glyoxalase I,GLY I)和4-羟基苯丙酮酸加双氧酶(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase,HPPD)亚家族。结构分析表明,大部分BnaVOC基因有2或3个内含子,BnaGLYI金属离子中心预测结果为螯合锌离子,而BnaHPPD金属离子中心预测螯合铁离子。共线性和进化分析结果表明,大部分的BnaVOC的祖先基因来源于拟南芥1号染色体的基因簇,并且此家族是芸薹属植物进化过程中的不均一多倍化事件(mesopolyploidy events)作用后的产物。全基因组复制事件和片段化复制对其扩张起主要作用。对甘蓝型油菜的各个组织,以及不同干旱处理时期的甘蓝型油菜种子进行表达谱分析,相比其他组织,在叶片和晚期发育的果荚(播种30周后)中,大部分的VOC家族成员的表达量较高。在干旱胁迫的情况下,相比于低含油量的油菜果荚,高含油量的油菜果荚中,大部分VOC家族成员的基因表达量较高。(3)利用分子生物学手段,对4个BnLEA3基因,4个BnVOC基因,以及拟南芥同源的AtLEA3基因,AtVOC基因,共10个基因进行克隆。分别构建种子特异表达启动子和35S启动子的超表达载体,其中,AtVOC基因还构建35S启动子的RNA干扰载体(AtVOC-RNAi),并转化野生型拟南芥。同时,购入AtLEA3基因突变体(atlea3),并克隆AtLEA基因全长,并构建AtLEA基因的1305互补载体,转化atlea3突变体。对转基因和突变体种子的含油量,脂肪酸组分,千粒重,种子大小进行分析,以及对转基因拟南芥进行干旱胁迫处理,并对其表型进行观察。相对于对照,超表达BnLEA3基因以及BnVOC基因的拟南芥转基因后代种子含油量提高15%-23%,脂肪酸组分发生相应变化,千粒重提高17%-30%,不同拷贝的BnLEA3基因和BnVOC基因的表现不同。干旱胁迫下,超表达株系相比于野生型,具有更高的叶绿素含量、相对含水量和叶表温度,较低的花青素含量,体现出更强的抗逆性。而atlea3突变体和atvoc-rnai干扰株系体现出低水平的抗干旱性。转入互补载体后对atlea3突变体表型恢复。(4)利用RNA-seq技术对长期干旱处理与短期干旱处理的BnLEA-OE,BnVOC-OE,AtLEA-OE,AtVOC-OE,atlea3突变体,AtVOC-RNAi,以及WT株系的果荚,叶片进行转录组测序和分析。与WT相比,在短期干旱处理的LEA系列种子中,AtLEA-OE,BnLEA-OE,atlea3突变体分别有1676,2707,695个差异表达基因(DEGs)。在LEA系列长期干旱处理的种子中,AtLEA-OE,BnLEA-OE,atlea3突变体分别有80,638,7个DEGs。GO富集和KEGG富集结果表明,不同株系的种子主要是在油脂合成,油脂消减代谢途径存在显著性差异。叶片中,主要是在光合作用,叶绿素合成,碳固定,植物激素信号传导,以及乙醛酸代谢中存在显著差异。最后,利用q-RTPCR对转录组结果进行验证,结果显示差异趋势一致。(5)将含有不同基因拷贝的超表达和RNA干扰(BnLEA3-OE,BnVOC-OE,BnLEA-RNAi,BnVOC-RNAi)载体转化甘蓝型油菜(Westar)。对转基因后代的种子进行分析,相比于野生型,OE株系的含油量提高11.8%-23.6%,RNAi株系的含油量降低13.1%-18.4%。同时OE株系种子变大,千粒重提高,而RNAi株系种子变小,千粒重下降。干旱胁迫后,超表达株系具有更强的抗干旱能力,同时其种子含油量受干旱影响小。而RNAi株系则拥有更弱的抗干旱能力。(6)针对转基因油菜的含油量的提高以及抗干旱性能的增强,将LEA与VOC的对应超表达和RNAi株系进行杂交,对杂交后代进行分析。并对干旱处理下的LEA系列的光合效率,VOC系列氧化还原系统的对应物质含量和酶活水平进行检测。结果显示,相比于单基因超表达株系,超表达株系的杂交后代的抗逆性能提升,并且含油量提高,RNAi杂交后代的抗旱性和含油量均下降。在干旱胁迫下,LEA基因可以有效帮助植株提高光合效率,VOC基因则降低了超氧化物和甲基乙二醛的积累,从而发挥抗干旱的功能。综上所述,甘蓝型油菜和拟南芥的LEA3和VOC基因不仅可以在干旱胁迫中发挥功能,提高光合效率,稳定细胞发育,还可以在油脂代谢中起作用,主要通过增强油脂的合成,降低油脂消减,降低活性氧对细胞的毒害作用,保证种子在干旱胁迫下的正常发育,从而实现含油量的提高。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S565.4
【图文】：

三酰基甘油,脂肪酸,植物,途径

6 植物中脂肪酸和三酰基甘油的合成途径[41]（左边质体中为自由脂肪酸的合成过程中为 TAG 的组装过程。关键物质：蔗糖、丙酮酸、乙酰辅酶 A、丙二酰辅酶 A、酶 A、溶血磷脂酸、磷脂酸、甘油二酯） 1.1 Fatty acid and TAG production in plants[41](Left: Free FA synthesis process in plasti production in endoplasmic reticulum. Key components: sucrose, pyruvate, acetyl CoA, mCoA, acyl CoA, lysophosphatidic acid, phosphatidic acid, diacylglycerol)植物油脂的降解于植物种子而言，油脂是能量的储存形式，也需要在种子萌发，生长需，从而提供能量。TAG 首先在脂肪酶的作用下，降解为甘油与游离的脂脂肪酸可以被 β-氧化。每一次 β-氧化需要经过脱氢，水合，再脱氢，，在脂酰 CoA 脱氢酶、烯脂酰 CoA 水化酶、羟脂酰 CoA 脱氢酶以及硫解酶的催化下完成，最终形成乙酰 CoA 和脂酰 CoA[41]。

物种,系统进化关系,分布解,低等植物

图 2.1 多个物种 LEA 基因家族成员分布解析图（左侧为物种之间系统进化关系，从低等植物，如藻类到高等单双子叶植物；右侧表格为 LEA家族的 8 个亚家族在各个物种中的数目分布）Figure 2.1 Distribution analysis of LEA genes in different plant species (Left: Phylogenetic relationship of different plant species, including lowerplants, such as algae and higher plants, such as eudicots and monocots; Right: The sheet show detail numbers of members in each LEA subfamilies inthese plant species)

序列,系统发育分析,重复抽样,家族

华中科技大学博士学位论文 BnLEA 基因家族的序列比对与系统发育分析108 个 BnLEA 基因全部进行多序列比对，并构建系统发育进化树（图 2.2示，八个亚家族之间相似性程度不高，共形成八个主要的分枝。LEA_6 的性最强。LEA_1 与 LEA_6 虽然存在不同的保守结构域，但是其序列在系统中的关系更近。此现象还发生在 BnLEA14，此基因的结构域属于 LEA_4 亚其在进化上却与 LEA_5 亚家族更接近。大部分的 BnLEA 基因出现成对现象（Gene pairs）。其中，40 对成对基因有举值（100%）。其余 3 对成对基因也具有相对较高的自举值，达到 90%-9分的基因对有较短的分枝长度，说明其分化在进化上发生的时间不长。以明了在进化过程中，大部分 BnLEA 基因是保守的，可是还是存在个别的分高的现象。

【参考文献】