cp4-epsps基因在毕赤酵母中的表达及鉴定

发布时间：2020-07-08 11:53

【摘要】：为建立一种新的外源蛋白安全评估方法,构建转外源基因酵母是关键步骤。本研究以来源于转基因作物的抗除草剂合成酶蛋白CP4-EPSPS为研究模板,首先通过基因优化和化学合成获得cp4-epsps基因,优化后基因密码子适用性指数(CAI)为0.85,GC含量为52%。目的基因克隆至毕赤酵母表达载体p PICZb,经鉴定筛选正确的重组载体p PICZb-EPSPS电击转化至毕赤酵母GS115,cp4-epsps基因通过同源重组方式整合至酵母基因组,PCR扩增酵母基因组筛选得到在正确位点发生同源重组的4株阳性菌株。随后,各阳性菌株分别于28℃、250~300 r/min培养,0.5%甲醇诱导4 d后,提取各组菌株总蛋白,采用SDS-PAGE和western blotting鉴定CP4-EPSPS表达的正确性。CP4-EPSPS单克隆抗体及载体标签C-MYC单克隆抗体的western blotting结果一致显示cp4-epsps基因在毕赤酵母GS115中成功获得表达,大小约50 ku。本实验成功构建了转cp4-epsps基因的毕赤酵母基因工程菌,为下一步开展转基因作物CP4-EPSPS成份的安全评价奠定基础。
【图文】：

加等体积2×SDS上样缓冲液煮沸，待蛋白电泳。1.2.5CP4-EPSPS蛋白的westernblotting鉴定采用SDS-PAGE分离蛋白样品，同时PVDF膜采用甲醇预处理3~5s，放至转印液浸润半小时。电泳结束后取出凝胶，通过电转移将蛋白转移至PVDF膜，低温操作，100V恒压60~120min，取出杂交膜，TBST漂洗5min三次，5%脱脂奶粉溶液室温封闭1h，TBST洗膜三次，加入CP4-EPSPS单克隆抗体(1:500)4℃过夜，TBST洗膜三次，Rabbitanti-mouseIgG-HRP(1:5000)稀释液37℃孵育1h，TBST洗膜，放至暗盒，显影。2结果与分析2.1pPICZb-EPSPS重组载体构建图1pPICZb-EPSPS重组载体构建流程图Fig.1TheconstructionofpPICZb-EPSPSvector图1为pPICZb-EPSPS重组载体构建流程图。其中化学合成的cp4-epsps基因首先克隆在pUC57载体上。pPICZb载体大小为3328bp，载体上SfuI和XbaI位点为cp4-epsps基因的同源重组位点，HindIII和EcoRV位点为pPICZb-EPSPS重组载体的鉴定位点。2.2cp4-epsps基因的优化及扩增为提高mRNA的稳定性及蛋白表达效率[24,25]，须根据毕赤酵母细胞Pichiapastoris的偏好性进行cp4-epsps基因密码子优化，减小稀有密码子的使用，提高最优密码子在基因序列中的比例，同时使基因的GC含量保持在30~70%之间，丰富的GC含量可大大提高该基因的表达水平[26]，低水平GC含量将限制基因转录[26,27]。基因优化结果见图2和图3，优化序列见附件1。

现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2017,Vol.33,No.1158图2密码子适用性指数Fig.2CodonAdaptationIndexes(CAI)注：该图为基因序列各密码子的利用率分布图。一般认为当CAI为1.0时，基因表达水平最为理想，CAI值越高，其表达水平越高。图3不同利用率密码子在基因中的百分含量Fig.3FrequencyofOptimalCodons(FOP)图2为基因序列中各密码子的利用率分布图，由密码子适用性指数（Codonadaptionindex，CAI）表征。通常认为，当CAI为1.0时，是菌株表达最理想状态，其表达水平最高，当CAI>0.9时，表达水平理想。图2结果所示，序列经优化后，其CAI值由0.77增加至0.85，表明理论表达水平将得到提高。图3为不同利用率密码子的百分含量。由图可知，原始序列中利用率在90~100%的密码子所占比例约50%，序列经优化后，所占比例大于55%，提高了利用率在90~100%的密码子的含量，同时利用率在70~80%，60~70%和50~60%的密码子的含量相应提高。序列经优化后，大大降低了稀有密码子的比例。研究表明[25]当最优密码子含量低于40%时，mRNA的平均半衰期为5.4min，当最优密码子含量高于70%时，mRNA的平均半衰期为17.8min，可见密码子的优化对稳定mRNA有重要作用。经过优化，序列中平均GC含量由最初49%提高至52%。KudlaG等[26]研究比较了同一基因GC丰富序列和GC贫乏序列在哺乳动物细胞中的表达情况，发现GC含量丰富的序列更易进行有效的转录或mRNA的加工处理，GC含量丰富的序列通过提高mRNA的稳定性从而提高基因的表达水平。在基因优化过程中同时还去除A/T或G/C重复序列，避免mRNA形成发夹结构或其它特殊结构，防止mRNA过早终止翻译[28,29]。最后，基于GenbankKP212901.1cp4-epsps基因序列(1368bp)，GS115菌株偏好性和载体要?

现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2017,Vol.33,No.1158图2密码子适用性指数Fig.2CodonAdaptationIndexes(CAI)注：该图为基因序列各密码子的利用率分布图。一般认为当CAI为1.0时，基因表达水平最为理想，CAI值越高，其表达水平越高。图3不同利用率密码子在基因中的百分含量Fig.3FrequencyofOptimalCodons(FOP)图2为基因序列中各密码子的利用率分布图，由密码子适用性指数（Codonadaptionindex，CAI）表征。通常认为，当CAI为1.0时，是菌株表达最理想状态，其表达水平最高，当CAI>0.9时，表达水平理想。图2结果所示，序列经优化后，其CAI值由0.77增加至0.85，表明理论表达水平将得到提高。图3为不同利用率密码子的百分含量。由图可知，原始序列中利用率在90~100%的密码子所占比例约50%，序列经优化后，所占比例大于55%，提高了利用率在90~100%的密码子的含量，同时利用率在70~80%，60~70%和50~60%的密码子的含量相应提高。序列经优化后，大大降低了稀有密码子的比例。研究表明[25]当最优密码子含量低于40%时，mRNA的平均半衰期为5.4min，当最优密码子含量高于70%时，mRNA的平均半衰期为17.8min，可见密码子的优化对稳定mRNA有重要作用。经过优化，序列中平均GC含量由最初49%提高至52%。KudlaG等[26]研究比较了同一基因GC丰富序列和GC贫乏序列在哺乳动物细胞中的表达情况，发现GC含量丰富的序列更易进行有效的转录或mRNA的加工处理，GC含量丰富的序列通过提高mRNA的稳定性从而提高基因的表达水平。在基因优化过程中同时还去除A/T或G/C重复序列，避免mRNA形成发夹结构或其它特殊结构，防止mRNA过早终止翻译[28,29]。最后，基于GenbankKP212901.1cp4-epsps基因序列(1368bp)，GS115菌株偏好性和载体要?

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本文编号：2746502