苹果小吉丁虫对寄主植物挥发物的行为反应及嗅觉相关基因功能研究

发布时间：2020-07-08 09:25

【摘要】：苹果小吉丁虫(Agrilus mali Masumura)是一种重要的蛀干害虫,主要危害蔷薇科、苹果属的多种经济林树种。近年来,在新疆苹果树上发生严重,特别对新疆天山野果林主要建群树种—新疆野苹果几乎造成毁灭性破坏。该害虫幼虫期长,钻蛀植物韧皮部取食为害,成虫生活期短,取食寄主植物叶片补充营养后,选择合适的产卵场所繁殖后代,所以成虫期是防治的关键时期。寄主植物挥发物在成虫选择寄主植物过程中发挥重要作用,苹果小吉丁虫能够通过灵敏的嗅觉系统感受寄主释放的主要挥发物组分识别寄主植物。目前对该害虫化学生态方面的研究还是空白,解析害虫与寄主植物的互作有利于明确该虫的寄主选择机制,为发展以植物源诱捕剂为主的绿色防治手段提供理论和技术依据。本研究鉴定了寄主和非寄主植物叶片释放的挥发性物质,利用二代转录组测序技术挖掘苹果小吉丁虫触角中相关的嗅觉基因,测定气味结合蛋白和化学感受蛋白基因结合寄主植物挥发物的能力,通过电生理和行为生理试验筛选出对害虫有较强吸引趋性的挥发性化合物,主要结果如下:苹果小吉丁虫对4种植物垂丝海棠、秦冠苹果、杜梨和秦王的选择偏好性和取食量存在明显差异。雌虫偏好在海棠和苹果上取食活动,对梨和桃的选择率较低。无竞争和两项竞争条件下,雌虫对海棠叶片的取食量最大,其次为苹果,但不取食梨和桃树叶片,表明海棠和苹果是该虫的寄主植物,梨和桃是非寄主植物。利用动态顶空吸附法收集寄主和非寄主植物叶片释放的挥发物,GC-MS共鉴定到71种化合物,包括5种烷烃,2种醚,11种醇,2种酮,8种醛,23种酯,4种烯烃,15种萜类和1种腈类物质,每种化合物的含量在4种植物间存在差异。通过对所有挥发性化合物含量进行因子分析,发现这些物质聚类形成3个代表性复合因子,累计解释总方差概率的93.62%。复合因子1、2、3中贡献率较大(绝对值大于0.7)的物质分别有25、19和15种,分别解释了总方差概率的41.98%、31.82%和19.83%。对3个复合因子总得分进行方差分析,结果表明对复合因子1、2、3贡献率大的分别是苹果、桃和海棠叶片释放的挥发物组分。利用复合因子1和2进行主成份分析,表明苹果和桃树叶片释放的挥发物组分含量差异较大,海棠和梨树叶片释放的挥发物组分含量差异较小。采用Illumina HiSeq二代测序平台对苹果小吉丁虫雌、雄虫触角转录组进行测序,共鉴定到63条嗅觉相关基因,包括11条OBP、8条CSP、17条OR、9条GR、17条IR和1条SNMP基因。系统进化树结果表明苹果小吉丁虫触角AmalOBPs、AmalCSPs、基因分别与其它鞘翅目昆虫序列聚类到不同的分枝,说明在进化过程中较分化;共同受体AmalORco、AmalIR8a和AmalIR25a以及AmalSNMP1基因分别与其它鞘翅目昆虫序列聚类到同一分枝,表现出进化过程中的高度保守性。苹果小吉丁虫触角中共鉴定到11条OBP基因,全部具有完整的开放阅读框,编码132~149个氨基酸,序列N端分布有16~20个氨基酸组成的信号肽。其中5条基因序列中包含6个保守的的半胱氨酸,属于“Classic OBP”亚族,分别为AmalOBP1,AmalOBP2,AmalOBP3,AmalOBP4,AmalOBP5;5条基因序列中包含4个半胱氨酸,与“Classic OBP”相比缺少第2和第5位的半胱氨酸,属于“Minus-C OBP”亚族,分别为AmalOBP7,AmalOBP8,AmalOBP9,AmalOBP10,AmalOBP11;AmalOBP6属于“Plus-C OBP”亚族,序列中含有8个保守的半胱氨酸,并在第六个半胱氨酸后紧接一个脯氨酸。苹果小吉丁虫触角中共鉴定到8条CSP基因,除了AmalCSP7在3′端缺失部分碱基不完整,其余7条均具有完整的开放阅读框,编码119~137个氨基酸,在N端具有16~22个氨基酸组成的信号肽。荧光定量PCR结果表明AmalOBP1、AmalOBP2、AmalOBP3、AmalOBP4、AmalOBP6和AmalOBP7这6条基因在雌、雄虫触角中特异性或高丰度表达,但在头、胸、腹、足和翅中表达量很低,表明它们可能执行嗅觉反应功能。有3条基因(即AmalOBP5,AmalOBP8和AmalOBP9)不仅在雌、雄虫触角中有较高的表达量,而且在成虫腹部和翅中也表现较高的表达水平,说明它们在参与嗅觉识别过程的同时,也参与到其它的生理过程。AmalOBP10和AmalOBP11分别在雄虫和雌虫腹部特异性地表达,表明它们可能与成虫感受和释放信息素的生理过程有关。AmalCSP2和AmalCSP3均在雌、雄触角中特异性表达,表明它们可能识别气味物质,参与成虫嗅觉反应过程。通过对苹果小吉丁虫触角中表达量较高的4条OBP和2条CSP基因进行原核表达,发现这6个蛋白均以包涵体的形式表达。通过对重组蛋白包涵体稀释复性,利用Ni离子亲和层析柱纯化重组蛋白,获得了高纯度的目的蛋白。蛋白印记杂交分析表明纯化后的重组蛋白在14~17 KDa左右出现明显的单一目的条带,说明目的蛋白纯化质量高。采用BCA方法测得纯化后的目的蛋白AmalOBP1、AmalOBP3、AmalOBP7、AmalOBP8、AmalCSP2和AmalCSP3的质量浓度分别为1.28、1.53、0.61、0.58、0.90和1.12 mg/mL。利用GraphPad Prism 5软件对重组蛋白与荧光探针1-NPN结合产生的最大荧光强度值进行非线性回归拟合,测得重组蛋白AmalOBP1、AmalOBP3、AmalOBP7、AmalOBP8、AmalCSP2和AmalCSP3的结合常数(K_d)分别为1.17、8.63、4.52、4.69、8.87和8.10μM。荧光竞争结合试验结果表明AmalOBP1和AmalOBP7对寄主植物挥发物的结合谱较窄,AmalOBP1仅能结合法尼醇(K_i=23.27±0.06μM)、2,4-癸二烯酸乙酯(K_i=35.54±0.22μM)、己酸叶醇酯(K_i=36.67±0.21μM)和莰烯(K_i=35.36±0.06μM);AmalOBP7对十二醇(K_i=14.94±0.36μM)、法尼醇(K_i=21.60±0.35μM)和十二醛(K_i=14.46±0.21μM)表现出较高的结合能力,也能结合α-罗勒烯(Ki=32.28±0.26μM)。AmalOBP3和AmalOBP8能广谱地结合15和22种化合物,包括醇、醛、酯和萜类物质,不结合烯烃和烷烃类物质。AmalOBP3和AmalOBP8均能强烈地结合主链碳原子数在C12-15的十二醇、十四醇、橙花叔醇和法尼醇(K_i?6μM);它们对主链碳原子数在C10-12的乙酸辛酯、甲酸香叶酯、桃醛、2,4-癸二烯酸乙酯和己酸叶醇酯也表现出很强的结合能力(K_i=7.09~31.90μM)。此外,AmalOBP3和Amal OBP8均对(4E,6Z)-2,6-二甲基-2,4,6-辛三烯和α-罗勒烯(K_i=7.72~15.71μM)表现很强的结合能力。AmalCSP2和AmalCSP3分别能选择性的结合9和7种化合物(K_i?40μM),其中AmalCSP3对十四醇(K_i=1.52±0.01μM)具有特别强的结合能力。以上结果表明这6条基因均能识别寄主植物挥发物组分,共同参与到成虫对寄主挥发物的嗅觉反应过程中。在23种与重组蛋白AmalOBPs和AmalCSPs结合效果较好的寄主植物挥发物中,雌虫对癸醛、甲酸香叶酯、2,4-癸二烯酸乙酯、己酸叶醇酯和(4E,6Z)-2,6-二甲基-2,4,6-辛三烯,雄虫对法尼醇、癸醛和己酸叶醇酯表现强烈的触角电位反应,EAG相对值均大于1.0。双向嗅觉行为试验表明(4E,6Z)-2,6-二甲基-2,4,6-辛三烯、甲酸香叶酯、己酸叶醇酯、癸醛和十四醇对雌虫具有显著的吸引效果,己酸叶醇酯对雄虫表现出强烈的吸引作用,其它物质均不能引起雄虫明显的行为反应,表明以上几种气味化合物在成虫选择合适的寄主植物取食和产卵过程中发挥重要作用。田间诱捕试验表明雌、雄虫均对黄色诱虫板的趋性最强,每个诱捕器10天诱捕量为雌虫14.33±1.09头、雄虫5.67±1.52头和总虫数20.00±2.57头,其次为绿色,雌虫11.67±0.88头、雄虫5.33±0.72头和总虫数17.00±1.16头,这两种颜色均适合用于田间诱捕试验。此外,癸醛对雌、雄成虫具有良好的诱捕效果,每个诱捕器10天的诱捕量为雌虫14.00±1.53头、雄虫7.00±1.53头和总虫数21.00±2.00头。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S433
【图文】：

气味物质,昆虫,机制

图 1-1 昆虫识别和感受气味物质的机制（Sanchez-Gracia et al. 2009）Fig. 1-1 Schematic view of the odorant perception process in insects（Sanchez-Gracia et al. 2009 昆虫嗅觉相关基因研究1 昆虫触角基因组和转录组研究昆虫的不同物种生物学特性差异很大，基因组包含的信息也存在巨大差异，仅昆虫的基因组信息对深入研究和解释其它物种的表型差异存在困难（张传溪生物信息学技术的快速发展，基因组测序成本大大降低，近年来多种昆虫的基序，通过分析能够获得比较全面的嗅觉相关基因信息。如双翅目的黑腹rosophilamelanogaster）（Hekmat-Scafeetal.2002）和冈比亚按蚊（Anophelesgamuetal.2003）、鳞翅目的家蚕（Bombyxmori）（Gongetal.2009）、蜚蠊目的美洲eriplaneta americana）（Li et al. 2018）、半翅目的豌豆蚜（Zhou et al. 2010）、膜大利蜜蜂（Apis melifera）（Robertson and Wanner 2006）以及鞘翅目的赤拟ribolium castaneum）（Richards et al. 2008）、光肩星天牛（Anolophora glabripencKennaetal.2016）、大红埋葬甲（NicrophorusVespilloides）（Cunninghametal.20

示意图,气味结合蛋白,气味,昆虫

图 1-2 昆虫气味结合蛋白与气味配体的荧光竞争结合示意图（Zhuang et al. 2013）. 1-2 Schematic representation of competitive binding assays beween OBP proteins and odour ligusing a fluorescent probe（Zhuang et al. 2013）在触角中大量表达的 OBPs 通常能够识别和结合寄主植物挥发物或昆虫性信昆虫的嗅觉反应过程。棉铃虫 HarmPBP1 能强烈结合信息素组分顺-11-碳烯醛烯醛，蛋白三维结构和分子柔性对接分析表明关键性结合位点分别是 Ser9、Tr36、Phe119 和 Thr112、Lys111、Phe119（Zhang et al. 2012）。桔小实蝇 BdorOB和多种引诱剂结合，在调节害虫趋性方面具有重要作用（Wu et al. 2016）；枣sOBP3 能强烈结合性信息素 α-法尼烯，CvesOBP2 能结合乙酸顺-3-己烯酯，CvesvesOBP4 能结合枣果实释放的挥发物组分石竹烯和花柏烯（Li et al. 2017）。苜AlinOBP6 在雌虫触角的锥形和刺形感器中特异性表达，能够结合寄主挥发物组发性酚类物质，在成虫嗅觉和味觉反应过程中发挥作用（Sun et al. 2017）。巢（Megouraviciae）MvicOBP3均能结合 (E)-β-farnesene、α-pinene、β-pinene和lim报警信息素，蛋白结构中的芳香族残基与气味配体形成稳定的共价键能促进两（Northey et al. 2016）。美洲大蠊 PmacOBP24 在雌、雄触角中均特异性表达，

海棠,植物叶,苹果,重量

图 2-1 苹果小吉丁虫对四种植物的选择着落数量. 2-1 The number of Agrilus mali adults observed on foliage of four test p丁虫对四种植物叶片的取食量 4 种植物的不同大小的叶片面积（cm2）和重量（g），建立分别为：海棠 Y=0.0141X+0.0198，R2=0.95；苹果 Y=0.0Y=0.0300X-0.0979，R2=0.95；桃 Y=0.0249X-0.0173，R2=0.的单位叶片重量，发现苹果（0.0240 g/cm2）和桃（0.0232 ，两者之间无显著差别（P>0.05），但它们均显著大于海棠（P=0.022，海棠 vs 苹果 P=0.007）；梨（0.0214g/cm2）的单位间差异不显著（P > 0.05）（图 2-2B）。

【引证文献】