Sec23a基因对人乳腺癌类肿瘤干细胞的干性抑制作用研究

发布时间：2020-07-09 06:41

【摘要】：该文使用新型悬浮细胞连续培养法从人乳腺癌细胞MDA-MB-435中分离出类肿瘤干细胞株(MDA-435-spheroid enrichment,MDA-435-SE),并通过流式细胞术检测细胞表面标志物以及裸鼠皮下成瘤实验,对MDA-435-SE细胞的类肿瘤干细胞特性进行了验证。然后对MDA-435-SE细胞进行慢病毒感染,建立了稳定敲低Sec23a基因表达的细胞株MDA-435-SE-sh Sec23a和阴性对照细胞株MDA-435-SE-LV3NC,通过Cell Counting Kit-8增殖实验、96孔板单克隆成球实验和裸鼠皮下成瘤实验探索Sec23a基因对乳腺癌类肿瘤干细胞MDA-435-SE的干性调控作用。在乳腺癌类肿瘤干细胞MDA-435-SE中敲低Sec23a基因后,细胞的增殖曲线和倍增时间并没有明显改变,但细胞的体外成球直径和单细胞克隆效率均显著增强。动物实验表明,Sec23a基因的敲低可以显著提高乳腺癌类肿瘤干细胞MDA-435-SE的体内成瘤能力。该研究使用新型悬浮细胞连续培养的方法获得来源于人乳腺癌的类肿瘤干细胞株,并使用体内和体外干性相关实验验证了敲低Sec23a基因后,可以显著提高乳腺癌类肿瘤干细胞MDA-435-SE的干性,对肿瘤干细胞的研究具有重要的参考意义。
【图文】：

A-435-SE细胞相对于MDA-MB-435细胞是否具有类肿瘤干细胞的特性,我们设置了1000个细胞剂量的裸鼠皮下成瘤实验。如图3所示,实验结果表明,MDA-MB-435细胞不具有裸鼠皮下成瘤能力,而通过新型悬浮细胞连续培养法获得的MDA-435-SE细胞具有很强的裸鼠皮下成瘤能力,说明MDA-435-SE细胞具有类肿瘤干细A:呈梭形分化贴壁生长的MDA-MB-435细胞;B:呈悬浮成球聚集生长的MDA-435-SE细胞。A:imageoffusiformadherentMDA-MB-435cells;B:imageofsuspendingsphericalMDA-435-SEcells.图1MDA-MB-435和MDA-435-SE细胞的不同生长形态Fig.1DifferentgrowthmorphologiesofMDA-MB-435andMDA-435-SEcells(A)(B)120m120m(A)(B)CD24PE-AQ1-LL(0.16%)Q1-LR(0.05%)Q1-UL(7.94%)Q1-UR(91.85%)Q1-LL(0.55%)Q1-LR(0.11%)Q1-UL(17.18%)Q1-UR(82.16%)CD24PE-ACD44APC-ACD44APC-A103104105103104103104103104105A:MDA-MB-435细胞中CD44和CD24的检测;B:MDA-435-SE细胞中CD44和CD24的检测。A:flowcytometryofCD44andCD24inMDA-MB-435cells;B:flowcytometryofCD44andCD24inMDA-435-SEcells.图2流式细胞术检测MDA-MB-435和MDA-435-SE细胞中CD44和CD24的表达Fig.2DeterminationofCD44andCD24inMDA-MB-435andMDA-435-SEcellsbyflowcytometry

周仕霞等:Sec23a基因对人乳腺癌类肿瘤干细胞的干性抑制作用研究651集的MDA-435-SE细胞,置于含5%胎牛血清、1%双抗和1%两性霉素B的DMEM培养基中进行连续传代、培养(图1)。2.2MDA-MB-435和MDA-435-SE细胞中CD44和CD24的表达CD44高表达并且CD24低表达是乳腺癌肿瘤干细胞的标志。我们使用流式细胞术检测MDA-MB-435和MDA-435-SE细胞中CD44和CD24的表达。如图2所示,在MDA-MB-435细胞中,CD44高表达与CD24低表达的细胞亚群比例为7.94%,而在MDA-435-SE细胞中,其比例为17.18%。此结果说明,采用的新型悬浮细胞连续培养法可以显著提高乳腺癌细胞中肿瘤干细胞亚群的比例,同时说明MDA-435-SE细胞相对于MDA-MB-435细胞具有类肿瘤干细胞的特性。2.3MDA-MB-435和MDA-435-SE细胞的裸鼠皮下成瘤能力比较为了进一步验证MDA-435-SE细胞相对于MDA-MB-435细胞是否具有类肿瘤干细胞的特性,我们设置了1000个细胞剂量的裸鼠皮下成瘤实验。如图3所示,实验结果表明,MDA-MB-435细胞不具有裸鼠皮下成瘤能力,而通过新型悬浮细胞连续培养法获得的MDA-435-SE细胞具有很强的裸鼠皮下成瘤能力,说明MDA-435-SE细胞具有类肿瘤干细A:呈梭形分化贴壁生长的MDA-MB-435细胞;B:呈悬浮成球聚集生长的MDA-435-SE细胞。A:imageoffusiformadherentMDA-MB-435cells;B:imageofsuspendingsphericalMDA-435-SEcells.图1MDA-MB-435和MDA-435-SE细胞的不同生长形态Fig.1DifferentgrowthmorphologiesofMDA-MB-435andMDA-435-SEcells(A)(B)120m120m(A)(B)CD24PE-AQ1-LL(0.

说明慢病毒感染有效敲低了SEC23A蛋白质水平(图6,P<0.001)。2.6敲低Sec23a基因对MDA-435-SE细胞体外增殖特性的影响使用CCK-8检测法检测MDA-435-SE-LV3NC和MDA-435-SE-shSec23a细胞的增殖特性,绘制生长曲线并计算细胞倍增时间。实验结果表明,MDA-435-SE-LV3NC和MDA-435-SE-shSec23a细胞的生长曲线趋势十分一致,两者倍增时间分别为26.95h和26.04h,并无显著差异(图7,P>0.05)。这说明,敲低Sec23a的表达并未影响MDA-435-SE细胞的增殖特性。图3MDA-MB-435和MDA-435-SE细胞的裸鼠皮下成瘤检测Fig.3TumorigenicitiesinthenudemiceofMDA-MB-435andMDA-435-SEcellsMDA-435-SE1000cellsMDA-MB-4351000cells120.0***100.080.060.040.020.00RelativeexpressionofmRNA(percentageofMDA-MB-435)(%)MDA-MB-435MDA-435-SE***P<0.001.图4RT-PCR检测MDA-MB-435和MDA-435-SE细胞中Sec23amRNA水平Fig.4TherelativelevelofSec23amRNAinMDA-MB-435andMDA-435-SEcellsmeasuredbyRT-PCR

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