禾谷缢管蚜ABC转运蛋白基因克隆及其表达特性研究

发布时间：2017-03-29 15:27

  本文关键词：禾谷缢管蚜ABC转运蛋白基因克隆及其表达特性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：禾谷缢管蚜Rhopalosiphum padi(L.)属于昆虫纲半翅目(Hemiptera)、蚜科(Aphididae),是具有刺吸式口器的重要麦类害虫之一,广泛分布于世界各地。该虫刺吸小麦汁液,使小麦不能灌浆或籽粒不饱满,造成千粒重下降,而且传播大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus,BYDV),每年给世界各地的小麦生产造成重大经济损失。化学杀虫剂喷施是防治禾谷缢管蚜的主要方法,长期大量使用化学杀虫剂已经导致该虫对多种杀虫剂产生抗药性,面对强大的杀虫剂选择压力,蚜虫通过基因突变、基因扩增、代谢酶活力改变等机制产生快速的进化与适应。已有研究表明,ABC(ATP-binding cassette)转运蛋白作为一种外排泵,其基因表达量上升可以降低细胞内部外源物质的有效浓度,导致昆虫对药剂的敏感性下降。本研究克隆得到禾谷缢管蚜部分ABC转运蛋白基因的全长序列并进行了生物信息学及表达模式分析,同时研究了ABC转运蛋白抑制剂维拉帕米对农药的增效作用,分析了禾谷缢管蚜ABC转运蛋白在杀虫剂抗性跨膜转运中的作用,研究结果对于深入阐明禾谷缢管蚜对杀虫剂的抗性机制具有重要意义。1.禾谷缢管蚜ABC转运蛋白基因克隆及其生物信息学分析本研究采用RT-PCR与RACE技术克隆获得了14个ABC转运蛋白基因Rhpa ABCA3,Rhpa ABCB6,Rhpa ABCB7,Rhpa ABCB10,Rhpa ABCC1,Rhpa ABCG1,Rhpa ABCG4,Rhpa ABCG4-1,Rhpa ABCG5,Rhpa ABCG9,Rhpa ABCG20,Rhpa ABCG23,Rhpa ABCG23-1和Rhpa ABCG23-2 c DNA全序列,其中Rhpa ABCG4和Rhpa ABCG4-1与Rhpa ABCG23,Rhpa ABCG23-1和Rhpa ABCG23-2可能是选择性剪切导致的异构体。14个基因的开放阅读框长度依次分别为5 837,2 818,2 337,1 812,5 463,3 074,2 678,2 443,2 437,2 924,3 872,2 383,2 432和2 256 bp,分别编码1 635,839,683,603,1 514,616,709,629,638,700,811,693,695和686个氨基酸。在NCBI上Blastp分析发现,这14个基因编码的氨基酸序列与豌豆蚜Acyrthosiphon pisum和麦双尾蚜Diuraphis noxia对应基因编码的氨基酸序列一致性最高,达到90%以上。结构分析表明,14个蛋白均具有ABC转运蛋白家族典型的结构特征,说明其均为禾谷缢管蚜ABC转运蛋白家族基因。通过ORF finder在线软件分析显示,各个基因均具有一个完整的开放阅读框。在系统进化树上,14个ABC转运蛋白与豌豆蚜和麦双尾蚜各对应蛋白距离最近;禾谷缢管蚜ABC转运蛋白分别位于系统发育树的两大支,其中A家族和G家族聚在其中一支,B家族和C家族聚在另外一支;G家族中G20和G23,G1和G4的进化关系较近,G20和G23位于其中一小支,G1和G4位于另一小支。2.禾谷缢管蚜ABC转运蛋白表达模式分析本研究采用实时荧光定量PCR技术,对禾谷缢管蚜ABC转运蛋白Rhpa ABCC1,Rhpa ABCG9,Rhpa ABCG20和Rhpa ABCG23在不同品系中的相对表达量进行分析,结果显示禾谷缢管蚜Rhpa ABCC1,Rhpa ABCG9,Rhpa ABCG20和Rhpa ABCG23在禾谷缢管蚜不同品系中均有不同程度的表达;本研究检测并分析了这4个基因在禾谷缢管蚜1-4龄若蚜和无翅成蚜的表达变化,结果显示这4个基因在禾谷缢管蚜整个发育历期均有表达,但这4个基因在不同发育时期表达的变化规律不同;为了明确禾谷缢管蚜多药耐药相关蛋白Rhpa ABCC1在禾谷缢管蚜不同组织的特异性表达分析,本研究检测并分析了禾谷缢管蚜无翅成蚜足,表皮,头部和中肠的特异性表达,结果显示Rhpa ABCC1在无翅成蚜4个不同组织中均有不同程度的表达,其中中肠表达量最高,为足的4.49倍;此外,本研究检测并分析了禾谷缢管蚜敏感种群在毒死蜱和吡虫啉药剂致死中浓度LC50处理12h、24 h、36 h和48 h后Rhpa ABCC1的相对表达量变化,研究结果表明,两种药剂处理后,禾谷缢管蚜Rhpa ABCC1均上调表达,其中吡虫啉处理48 h后的相对表达量与敏感品系差异显著。3.ABC转运蛋白抑制剂维拉帕米对杀虫剂增效作用的研究为了确定禾谷缢管蚜对杀虫剂的抗性是否由ABC转运蛋白介导,我们分别单独使用杀虫剂和杀虫剂与维拉帕米的结合使用对禾谷缢管蚜进行生物测定。结果显示,在终浓度为500μM的维拉帕米下,毒死蜱,异丙威,吡虫啉和氯氟氰菊酯的毒力分别增加2.72倍,1.40倍,1.64倍和1.50倍。此外,在终浓度为500μM的维拉帕米下,毒死蜱和吡虫啉在相应药剂抗性品系中的毒力分别增加1.33倍和1.26倍。
【关键词】：禾谷缢管蚜 ABC转运蛋白 基因克隆 表达分析 杀虫剂抗性 维拉帕米增效
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S435.12
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 文献综述12-30
• 1.1 禾谷缢管蚜12
• 1.2 昆虫对杀虫剂的抗性机理12-16
• 1.2.1 代谢抗性的分子生物学机制12-14
• 1.2.2 靶标抗性的分子生物学机制14-16
• 1.3 ABC转运蛋白及其介导的农药跨膜运输16-29
• 1.3.1 ABC转运蛋白分子结构及其作用机制16-19
• 1.3.2 ABC转运蛋白亚家族及其生理功能19-21
• 1.3.3 ABC转运蛋白在杀虫剂抗性跨膜转运中的作用21-22
• 1.3.4 ABC转运蛋白抑制剂22-29
• 1.4 研究目的与意义29-30
• 第二章 禾谷缢管蚜ABC转运蛋白基因克隆及其生物信息学分析30-53
• 2.1 材料与方法30-34
• 2.1.1 供试昆虫30
• 2.1.2 主要试剂及仪器30
• 2.1.3 RNA提取30-31
• 2.1.4 c DNA第一链的合成31
• 2.1.5 禾谷缢管蚜ABC转运蛋白基因全长的克隆31-34
• 2.1.6 禾谷缢管蚜ABC转运蛋白基因的序列分析及分子进化树的构建34
• 2.2 结果与分析34-50
• 2.2.1 禾谷缢管蚜ABC转运蛋白基因的克隆与序列分析34-44
• 2.2.2 分子系统进化分析44-50
• 2.3 讨论50-53
• 第三章 禾谷缢管蚜ABC转运蛋白的表达模式分析53-63
• 3.1 材料与方法53-56
• 3.1.1 供试昆虫53-54
• 3.1.2 主要试剂54
• 3.1.3 主要仪器54
• 3.1.4 禾谷缢管蚜不同发育阶段RNA提取54
• 3.1.5 禾谷缢管蚜无翅成蚜不同组织RNA提取54
• 3.1.6 禾谷缢管蚜抗性品系和敏感品系RNA提取54
• 3.1.7 禾谷缢管蚜药剂诱导处理RNA提取54
• 3.1.8 实时荧光定量PCR的引物设计54-55
• 3.1.9 实时荧光定量PCR检测不同处理的禾谷缢管蚜ABC转运蛋白基因的相对表达量55
• 3.1.10 数据分析55-56
• 3.2 结果与分析56-60
• 3.2.1 禾谷缢管蚜ABC转运蛋白基因不同发育时期相对表达量分析56-57
• 3.2.2 禾谷缢管蚜ABC转运蛋白基因Rhpa ABCC1不同组织相对表达量分析57
• 3.2.3 禾谷缢管蚜ABC转运蛋白基因不同品系相对表达量分析57-59
• 3.2.4 禾谷缢管蚜ABC转运蛋白基因Rhpa ABCC1吡虫啉和毒死蜱诱导不同时间的相对表达量分析59-60
• 3.3 讨论60-63
• 第四章 ABC转运蛋白抑制剂维拉帕米对杀虫剂的增效作用63-67
• 4.1 材料与方法63-64
• 4.1.1 供试昆虫63
• 4.1.2 供试药剂63
• 4.1.3 生物测定63-64
• 4.1.4 数据分析64
• 4.2 结果与分析64
• 4.3 讨论64-67
• 第五章 结论与展望67-69
• 参考文献69-81
• 致谢81-82
• 作者简介82

【参考文献】

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