加工番茄SlAGO4B基因功能鉴定

发布时间：2020-07-10 14:44

【摘要】：AGO蛋白是RNA沉默途径的核心蛋白,在RISC中扮演重要角色,AGO蛋白是一类保守蛋白,含四个保守的结构域AgoN、PIWI、PAZ和MID域。其中AgoN参与小RNA的解旋过程;PAZ和MID负责小RNA的识别和结合;PIWI具有类似RNaseH的功能,使得AGO蛋白具有催化切割功能,在RNA沉默途径中起着重要作用。本文从加工番茄cDNA文库,通过PCR技术获得SlAGO4B基因,分析了SlAGO4B的亚细胞定位以及与CMV 2b蛋白的相互作用,构建SlAGO4B基因过量表达载体,利用农杆菌介导的遗传转化获得转基因加工番茄。实验结果如下:1.SlAGO4B生物信息学分析:利用NCBI数据库,获得加工番茄Sl AGO4B序列信息,设计引物利用PCR扩增获得Sl AGO4B基因。利用ORF Finder在线软件,预测SlAGO4B开放阅读框和氨基酸序列;通过Expasy Protparma分析蛋白质分子量、等电点及氨基酸组成特征;信号肽和二级结构利用Signal P和SOPMA在线分析;蛋白结构域通过SMART数据库分析;利用MEGA7软件构建AGO蛋白系统进化发育树。结果显示SlAGO4B基因全长2742bp,编码913个氨基酸,包含了AGO蛋白保守的AgoN、PIWI、PAZ和MID域,还有DUF1785和AgoL2两个结构域。SlAGO4B为亲水性蛋白,不含有信号肽,不属于分泌型蛋白;利用MEGA7对番茄AGO蛋白家族和拟南芥AGO蛋白家族做系统进化树分析发现SlAGO4B与AtAGO4在蛋白进化同处于一个进化支,推测二者功能上可能存在一定的相似性。2.SlAGO4B亚细胞定位:将GFP基因与SlAGO4B基因进行融合,构建35S:GFP-SlAGO4B融合表达载体。利用农杆菌瞬时转化洋葱表皮细胞,利用激光共聚焦显微镜观察发现在洋葱表皮细胞的细胞核中出现荧光信号,同时遗传转化烟草在烟草原生质体中荧光信号主要出现在细胞核中,结果表明SlAGO4B定位在细胞核。3.利用GAL4酵母系统验证CMV 2b与SlAGO4B互作:将克隆SlAGO4B基因与酵母载体pGAD-T连接,构建pGAD-SlAGO4B,CMV 2b与诱饵载体pGBK-T连接,构建pGBK-CMV 2b。将此两个载体共转化AH109中,经氨基酸缺陷验证,与对照相比,发现pGAD-SlAGO4B和pGBK-CMV 2b在SD/-Leu-Trp-His缺陷培养基中生长,说明SlAGO4B与CMV 2b能够激活下游报告基因,CMV 2b与SlAGO4B可能存在相互作用。4.SlAGO4B基因植物过量表达载体构建及遗传转化:将过量表达载体35S:SlAGO4B利用农杆菌介导的方法遗传转化加工番茄,获得再生番茄,提取再生番茄总DNA,经PCR鉴定,获得过量表达番茄5个株系,为研究SlAGO4B基因功能提供遗传材料。
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2
【图文】：

SlAGO4B二级结构

O4B序列信息分析ORF Finder在线软件预测 SlAGO4B开放阅读框长 2742bSlAGO4B 的 PCR 扩增PCR amplification of SlAGO4Bker 5000；1：Sl AGO4B图 2.2 T-Sl4B单酶Fig. 2.4 Restriction enzyme digesM：Mark DL 5000，P：T-S

O4B序列信息分析ORF Finder在线软件预测 SlAGO4B开放阅读框长 2742bSlAGO4B 的 PCR 扩增PCR amplification of SlAGO4Bker 5000；1：Sl AGO4B图 2.2 T-Sl4B单酶Fig. 2.4 Restriction enzyme digesM：Mark DL 5000，P：T-S

【参考文献】

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本文编号：2749057