飞蝗内表皮蛋白基因的功能研究

发布时间：2020-07-10 16:37

【摘要】：昆虫表皮覆盖整个虫体,是昆虫身体的最外层组织,具有维持虫体形态、抵御外源物质入侵、防止体内水分蒸发等重要功能。昆虫体壁由上表皮、原表皮(内表皮和外表皮)和真皮细胞构成。昆虫表皮主要由几丁质、表皮蛋白和脂类组成。不同组织部位表皮结构不同,甚至同一组织部位在不同发育阶段,其化学组成和物理性质也存在显著差异性。表皮蛋白是昆虫表皮最主要的组分,影响昆虫表皮形态及机械特性。飞蝗是全球性的农业害虫,具有极强的暴发性,常以群居形式出现且迁飞能力强,蝗灾一旦暴发,受灾范围广,为害严重。因此,对于飞蝗表皮蛋白基因功能的研究,有利于掌握其在飞蝗生长发育过程中的作用,为筛选害虫防治新的靶标提供理论依据。本文以飞蝗为研究对象,利用飞蝗蛋白质组学分析筛选出3个内表皮蛋白LmNCP1、LmNCP2、LmCP6为研究对象,利用RNAi技术探讨其在飞蝗表皮发育过程中的生物学功能,研究结果如下:1、飞蝗表皮蛋白质组学分析根据已有研究报道,利用HE染色方法初步确定飞蝗内外表皮形成时间,提取表皮总蛋白进行SDS-PAGE检测,将该时间节点飞蝗表皮组织进行Lable free蛋白组学测定,筛选出3个在蜕皮后高表达的表皮蛋白基因,分别是Unigene3699、Unigene2044和Unigene669,推测其与飞蝗内表皮的形成有关。2、飞蝗3个内表皮蛋白基因的生物信息学分析对飞蝗3个内表皮蛋白基因进行生物信息学分析。发现Unigene3699含有2个外显子,编码101个氨基酸。含有1个信号肽,不含几丁质结合域,但具有3个在物种间具有保守性的重复基序。系统进化分析表明Unigene3699与Blaberus craniifer的BcNCP1亲缘关系最近,根据同源性,将其命名为飞蝗LmNCP1。Unigene2044有3个外显子,编码205个氨基酸,含有1个信号肽和1个几丁质结合域(ChtBD4);系统进化表明:Unigene2044与蜚蠊目Zootermopsis nevadensis若虫表皮蛋白2(CP2)具有较高的亲缘关系,因此,将其命名为飞蝗LmNCP2。Unigene669含有7个外显子,编码359个氨基酸,含有1个信号肽和1个几丁质结合域(ChtBD4)。系统进化表明:Unigene669与昆虫Cuticle Protein 6聚为一支,故命名为飞蝗LmCP6。3、飞蝗3个内表皮蛋白基因的mRNA表达特性分析根据已获得的飞蝗3个内表皮蛋白基因cDNA序列,设计相应的引物,通过RT-PCR扩增获得其全长并经测序验证;利用RT-qPCR技术,分析其组织和发育时期表达,组织部位表达显示,LmNCP1、LmNCP2和LmCP6分别在体壁和翅芽组织中特异性高表达;发育时期表达显示,LmNCP1和LmNCP2在5龄早期高表达,随后表达量逐渐降低,到下一次蜕皮前表达有所升高;LmCP6在5龄第1-6天(即N5D1-N5D6)表达量逐渐升高,下一次蜕皮前表达降低(即N5D7-N5D8)。20E诱导表达后,LmNCP1和LmCP6表达量显著上调,LmNCP2显著下调,分析表明LmNCP1、LmNCP2和LmCP6均参与20E调控途径;干扰20E受体EcR和早期转录因子HR3后,LmNCP1和LmCP6表达量显著下调,LmNCP2显著上调,分析表明LmNCP、LmNCP2和LmCP6分别参与EcR和HR3介导的20E调控通路。4、飞蝗3个内表皮蛋白基因LmNCP1、LmNCP2和LmCP6的功能研究由于LmNCP1、LmNCP2和LmCP6的发育时期表达与内表皮形成时间相一致,推测可能参与内表皮的形成。本文利用RNAi方法在飞蝗4龄和5龄第2天分次注射dsLmNCP1和dsLmNCP2后,发现飞蝗仍能够正常蜕皮,无致死表型,但对其表皮进行HE染色,发现与对照组相比,其内表皮形成量减少,导致表皮显著变薄。而沉默dsLmCP6后,飞蝗可发育至成虫,但处理组成虫翅变得卷曲、皱缩,说明其可能参与成虫翅的结构形成。飞蝗是典型的不完全变态昆虫,也是世界性的重要农业害虫。对于飞蝗表皮蛋白基因的研究,对于飞蝗有效治理具有重要意义。本文从飞蝗蛋白组学分析、飞蝗内表皮蛋白基因生物信息学分析、飞蝗内表皮蛋白基因mRNA表达特性分析以及飞蝗内表皮蛋白基因功能分析4个方面开展了飞蝗内表皮蛋白基因功能研究,为飞蝗分子靶标的筛选和研发提供了理论和实践依据。
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S433.2
【图文】：

昆虫体壁,结构示意图,表皮

图 1-1 昆虫体壁结构示意图[8]Fig. 1-1 The structure of insect integument表皮； Procuticle：原表皮；Exocuticle：外表皮；Endocuticle：内表皮真皮细胞层；Basement membrane：基底膜表皮蛋白分类皮蛋白（ICPs）是结构蛋白，根据其几丁质结合域的不同，类几丁质结合域为 R&R 基序（Rebers and Riddiford Consens-2 和 RR-3 三个亚类[9,10]，统称为 CPR 家族，该类表皮蛋白广另一类几丁质结合域为 the type 2 chitin-binding domain (ChtBD有 3 个二硫键（6 个半胱氨酸残基组成）保守序列，此类结构昆虫表皮和围食膜中[11,12]。守基序的不同，表皮蛋白可以分为以下几个家族：（1）CPR主要存在于昆虫的柔软表皮中、 RR-2 亚类主要存在于坚硬

路线图,研究方法,路线图

本文研究方法与技术路线图

飞蝗,外表皮,上表皮

11图 2-1 非标记蛋白质组学技术（lable-free）Fig.2-1 The non-labeled protemic technology（http://www.keecloud.com/label-free）[46]观察四龄刚刚蜕成五龄时飞蝗只有上表皮和外表皮（36 h 可观察到明显的内表皮，72 h 后内表皮基本

【参考文献】