百合体胚发生相关基因MIR171的克隆及其启动子功能分析

发布时间：2020-07-12 13:54

【摘要】：miRNA对植物体细胞胚发生具有重要的调节作用。本课题组前期研究中,以中国原产细叶百合为材料,筛选并鉴定了体细胞胚发生过程中关键差异表达的lpu-miR171a和lpu-miR171b。本研究在前期工作基础上,继续探讨了miR171参与调控百合离体再生的方式,克隆了MIR171a/b基因初级转录本全长及其上游5’端启动子序列,通过启动子-GUS报告系统分析了该启动子的功能和miR171基因的表达模式,从转录水平探讨了miR171调节百合体胚发生的机制。主要试验结果如下:(1)以细叶百合无菌苗淲片为外植体,分别通过直接和间接途径成功诱导发生了体细胞胚。体胚直接诱导最佳培养基为MS+4.0μmol·L~-11 PIC+0.01μmol·L~-11 ABA,胚性愈伤组织诱导最佳培养基为MS+4.0μmol·L~-11 PIC+25.0μmol·L~-11 SA,诱导率均达100%。两种途径体胚发生过程差异较大,直接发生途径中鳞片诱导产生球形胚后经历较长时间的心形胚阶段和短暂的鱼雷形胚时期,然后进入子叶期;间接发生途径中胚性愈伤组织分化形成球形胚后需经历较长的鱼雷形胚时期后进入子叶期,几乎观察不到心形胚时期。体细胞胚发生途径的胚性获得阶段,随体胚诱导率升高,miR171a/b的表达量下降,而其靶基因SCL6-II/I的表达量显著上升。在器官发生途径中,不定芽原基形成阶段miR171显著上调表达。分析认为,在百合离体再生过程中,miR171通过调节其靶基因SCL6参与了胚性获得过程。(2)MIR基因转录的最初产物初级转录本含有短的开放阅读框,能够通过编码短肽,在转录水平提高其特异miRNA表达。本研究采用RACE技术,克隆了细叶百合体胚发生相关MIR171a和MIR171b的全长初级转录本,大小分别为593 bp和404 bp,miR171家族不同成员间初级转录本的保守性较低。茎环结构pre-miR171a和pre-miR171b到转录起始位点(TSS)的距离分别为69 bp和22 bp,到3’polyA的距离分别为326 bp和239 bp。从TSS至pre-miR171的序列内,分别包含3个和1个短的开放阅读框。(3)使用FPNI-PCR的方法进行染色体步移,成功克隆MIR171a和MIR171b基因TSS 5’上游侧翼序列1450 bp和952 bp。这两序列中均含有TATA-Box、CAAT-Box等核心启动元件,以及多个相同或相似的转录因子结合位点,分析认为MIR171a和MIR171b的5’上游侧翼序列均有启动下游基因表达的能力。这两个miRNA具有独立的转录单元,且家族基因不同成员间在转录水平具有相似的调节模式。大量顺式作用元件集中分布于转录起始位点上游-1 kb范围,主要包括叶肉组织、根、花药和种子特异性表达元件,以及响应光照、非生物胁迫和细胞分裂素、脱落酸、茉莉酸、水杨酸、乙烯等多种植物激素的元件,表明MIR171的调控方式复杂,可能受多条信号通路的共同影响。此外,MIR171基因启动子序列内含有大量糖和淀粉代谢响应元件,表明MIR171参与了碳水化合物的代谢。(4)根据MIR171a全长启动子序列和顺式作用元件分析结果,克隆了五个不同长度的缺失启动子片段。将MIR171a基因的全长和缺失启动子片段连接GUS报告基因,构建植物表达载体,使用花序侵染法成功转化野生型拟南芥。经过逐代抗性筛选鉴定,获得了T3代转基因种子和植株。T3代转基因拟南芥植株组织化学染色结果表明,MIR171a基因的上游5’区域具有启动活性,可驱动GUS基因在拟南芥的子叶、幼根中稳定表达。高光胁迫下,初生真叶中也可检测到GUS基因的表达。其核心启动区域在TSS上游-232 bp范围内,-650 bp到-823 bp范围内存在特异性增强子。MIR171a启动子驱动GUS在拟南芥中的表达具有时空特异性,萌动时GUS表达量最高,随着植株生长逐渐下降,出芽15天后,检测不到GUS基因表达。根据MIR171a启动子的功能和miR171a在百合体胚发生中的表达模式,推测miR171a可能参与了体胚发生过程中子叶原基的发生和分化。(5)MIR171a启动子可以响应光照、非生物胁迫和激素信号。高光胁迫和光照变化会诱导GUS含量显著增加,其光照的响应区域定位在-650 bp到-823 bp之间。miR171启动子驱动GUS表达量在干旱和高盐胁迫条件下明显上调,但响应低温诱导的敏感程度较低。多种激素可以影响MIR171a启动子活性,在ABA、SA和MeJA等抗逆相关激素的作用下,GUS表达量升高,而BA则促使其表达量降低。植物体细胞胚发生过程中,往往伴随着大量的逆境响应,分析认为miR171a可能通过参与逆境响应调控细叶百合的体胚发生。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S682.29
【图文】：

过程图,细叶百合,体胚,过程

沈阳农业大学博士学位论文多个突起，这些突起会发育形成次生体胚。次生体胚会不断分化，会导增加。在体胚形成和生长发育过程中，接种的鳞片内部组织（非切割损、隆起，接种后 50 d，形成少量黄色、干燥、颗粒状的胚性愈伤组织。在适当条件下，也可经间接途径发育形成体细胞胚。a cb

靶基因,体胚发生,趋势

图 2-2 不同浓度 ABA 对 miR171a/b 及其靶基因 SCL6 II/I 的影响Fig.2-2 Expression profiles of miR171 and SCL6 II/I influenced byABA如图 2-2 所示，miR171 的表达量受培养基附加 ABA 的影响较大，且对 miR171a 和miR171b 的影响明显不同。ABA 的浓度为 0 到 10 μmol·L-1范围内，miR171a 的表达呈现先升高再下降的趋势。当 ABA 浓度为 0.01 μmol·L-1时，体胚发生率最高达 100%，miR171a 的表达量最低。随着 ABA 浓度的提高，体胚发生率逐渐下降，而 miR171a 的表达量逐渐提高，但表达量都低于对照；miR171a 的靶基因 SCL6-II 的表达与其呈相反趋势，当 ABA 浓度为 0.01 μmol·L-1时表达量最高，极显著高于其它处理，然后随 ABA浓度的提高逐渐降低。miR171b 的表达趋势与 miR171a 相似，随着 ABA 浓度的增加，体胚诱导率下降，miR171b 表达量呈现逐渐升高的趋势，也都低于对照；miR171b 的靶基因 SCL6-I 的表达量变化与 SCL6-II 明显不同，呈先升后降的趋势，当 ABA 浓度为 1μmol·L-1时表达量最高，极显著高于其它处理。此结果表明，百合两个 miR171 家族成员的表达量和体胚发生能力呈负相关，与相对应的靶基因则无明显的相关趋势（两个miR171 成员间与其靶基因相关趋势完全相反），此结果与贾娜娜（2016）的报道相符。这可能与靶基因的表达除了受 miRNA 调控之外，还参与了其他的代谢途径有关（Xue et

细叶百合,胚性愈伤组织,鱼雷形胚

沈阳农业大学博士学位论文常光照下培养，可经历球形胚、鱼雷形胚、子叶形胚最终成苗，主要表现为体胚间生，体胚发生过程和 Zhang 等（2016）的报道一致。间接再生与直接再生相比，没显的心形胚阶段，同时鱼雷形胚阶段明显，具有诱导时间长、体胚诱导率高，畸形率偏高的特点。a b c

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