淡紫拟青霉非还原型聚酮化合物合成基因簇的鉴定及表达分析

发布时间：2020-07-12 13:49

【摘要】：淡紫拟青霉(Purpureocillium lilacinum)是一种广谱性很强的生防菌,其分泌的水解酶类和次级代谢物对植物病虫害具有很好的防治作用。聚酮化合物是一种常见的次级代谢产物,它是由聚酮化合物合成酶(PKS)催化乙酸、丙二酸或丁酸等脱羧缩合而成,根据PKS对β-keto基团的还原程度,PKS被分为:非还原型聚酮合酶(NR-PKS)、部分还原型聚酮合酶(PR-PKS)及还原型聚酮合酶(HR-PKS),其中NR-PKS可以催化合成一环或多环的芳香型聚酮化合物。前期基因组数据预测淡紫拟青霉有4个NR-PKS基因,分别为VFPBJ_05021、VFPBJ_09342、VFPBJ_09755和VFPBJ_10843基因。Acremoxanthone C是由淡紫拟青霉所产的一种聚酮化合物,是氧杂蒽酮-蒽醌异二聚体,属钙调蛋白抑制剂,参与钙离子介导的信号转导途径,在新药发现中发挥重要作用。目前,关于Acremoxanthone C产生的分子生物学机制研究仍属空白,基于此本研究以淡紫拟青霉北京(BJ)菌株为材料,对其RNA-Seq数据进行分析,并通过qPCR验证4个NR-PKS基因簇的转录组表达量,对VFPBJ_09756基因进行超表达,比较野生型和超表达菌株的产物。具体研究结果如下:对VFPBJ_05021、VFPBJ_09342、VFPBJ_09755和VFPBJ_10843基因簇的RNA-Seq数据进行分析,并提取RNA,反转录成cDNA,进行qPCR验证这4个基因簇的转录组表达。结果显示VFPBJ_05021、VFPBJ_09342、VFPBJ_09755和VFPBJ_10843四个基因簇的转录组表达趋势与qPCR表达趋势基本一致。VFPBJ_05021、VFPBJ_09342和VFPBJ_09755基因簇都有成簇共表达趋势,即簇内基因表达量比簇外基因表达量相对较高。而VFPBJ_10843基因簇则相反,其簇内基因表达量很低,尤其簇内合成酶基因几乎不表达,但簇外基因却有很高的表达量,故初步确定VFPBJ_05021、VFPBJ_09342和VFPBJ_09755基因簇可能为Acremoxanthone C的候选合成基因簇。对VFPBJ_05021、VFPBJ_09342和VFPBJ_09755基因进行敲除载体构建。VFPBJ_09342基因簇内存在VFPBJ_11784转录因子,VFPBJ_09755基因簇内有VFPBJ_11786和VFPBJ_09756转录因子,对VFPBJ_11784、VFPBJ_11786和VFPBJ_09756基因进行超表达载体构建。对敲除载体(VFPBJ_05021、VFPBJ_09342和VFPBJ_09755基因)和超表达载体(VFPBJ_11784、VFPBJ_11786和VFPBJ_09756基因)进行原生质体转化,由于淡紫拟青霉产孢量大,培养时间过长,原生质体质量不佳及时间有限问题,只得到VFPBJ_09756超表达转化子。qPCR比较分析野生型菌株和VFPBJ_09756超表达菌株,结果显示在VFPBJ_09756超表达菌株中,VFPBJ_09755基因簇内VFPBJ_09756(编码真菌Zn(2)-Cys(6)双核簇)和VFPBJ_09755(聚酮化合物合成酶)基因表达量上调,同时VFPBJ_09752(编码单羧酸通透酶类似蛋白)、VFPBJ_09754(编码金属-β内酰胺酶超家族蛋白)、VFPBJ_09761(编码黄曲霉毒素调控蛋白结构域)及VFPBJ_09762(编码NAD依赖的表异构酶/脱水酶)基因表达量也上调,而VFPBJ_09755基因簇外大部分基因表达量并未上调。HPLC-QTOF-MS联用比较分析野生型菌株和VFPBJ_09756超表达菌株在大麦、MYIZ、MYOG、玉米、MYM、V8、胡萝卜、番茄、LP和TSSM等10种培养基中分离到的发酵粗提物。结果显示:在V8培养基中,7.8 min、8.25 min、9 min时,VFPBJ_09756超表达菌株的色谱峰明显高于野生型菌株,分别提取这四个时间段的质谱图,发现7.8min时物质的质荷比(m/z[M+H]~+)为1234.8,与物质Leucinostain k对应;在8.25 min时物质的质荷比(m/z[M+H]~+)为1204.8,该物质可能为Leucinostain B;在9 min时物质的质荷比(m/z[M+H]~+)为1104.8,该物质可能为Leucinostain A。在大麦培养基中,比较发现在8.15 min时,VFPBJ_09756超表达菌株的色谱峰高于野生型菌株,其所对应的物质的质荷比(m/z[M+H]~+)为1204.8,可能为Leucinostain B。在MYOG培养基中,比较发现在7.7 min和8.22 min时,VFPBJ_09756超表达菌株的色谱峰高于野生型菌株,在7.7 min时对应质荷比为1190.8,可能为Leucinostain C;在8.22 min时所对应的荷比为1204.8,可能为物质Leucinostain B。然而在其它几种培养基中,野生型菌株和VFPBJ_09756超表达菌株分离到的粗提物差异不大。综上所述,VFPBJ_05021、VFPBJ_09342和VFPBJ_09755基因簇可能为聚酮化合物Acremoxanthone C的合成基因簇,VFPBJ_09756基因调控VFPBJ_09756基因簇中基因的表达。
【学位授予单位】：山西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S476
【图文】：

分子结构图,分子结构,结构域,核糖体

图 1-1 Acremoxanthone C 和 acremonidinA 的分子结构[36]Figure 1-1 The molecular structure ofAcremoxanthone C and acremonidinA[36]非核糖体肽化合物核糖体肽类化合物由 NRPS（Non-ribosomal peptide synthetases）催化合成，体肽的氨基酸包括蛋白氨基酸和非蛋白氨基酸。每个 NRPS 可划分为个或Module），每个模块含有多个结构域，其中有 3 个结构域是必п可少的，包nylation）结构域，其作用是激活特异的氨基酸；T（Thiolation）或者 PCP（Pepprotein）结构域，其作用是转运肽链；C（Condensation）结构域，其作用是形成肽键[40]。73 年，Arai T 等[41]首次发现淡紫拟青霉能产生种抗生素 Leucinostatins（白，它是种非核糖体肽类化合物，对肿瘤细胞、真菌和革兰氏阳性菌有抑杀作

分子结构,前列腺,锥形,基质细胞

hiyama A 等发现 LeucinostatinA 和 B 对引起非洲人类锥虫病的锥形虫有很好的抑制用，锥形虫 ATP 合成酶的п完整会减慢细胞生长，而 LeucinostatinA 和 B 是线粒体解联剂、ATP 合成的抑制剂，同时 LeucinostatinA 是离子载体，可以破坏寄生虫体内平，因此对锥形虫有很好的抑制作用。肿瘤细胞总是被基质细胞围绕着，并п单独存在，eucinostatinA 是肿瘤-基质细胞互作的调节子。2008 年，Kawada 等发现前列腺 DU-145细胞у前列腺基质细胞共培养，相比前列腺 DU-145 癌细胞单独存在时 LeucinostatinA前列腺癌细胞有更好的抑制作用[45]。但当时对 LeucinostatinA 的抑制机理并п明白，010 年，Kawada 等通过 RT-PCR 揭示了 LeucinostatinA 通过减少前列腺基质细胞中胰岛类似生长因子来抑制前列腺 DU-145 癌细胞的生长[46]。但 LeucinostatinA 的浓度у对列腺癌细胞的生长抑制作用有何关系，在体内使用时 LeucinostatinA 的浓度应保持在范围，这些问题仍值得研究。2017 年 9 月，Abe 等通过非对称全合成 LeucinostatinA，结合核磁共振数据、高效液相色谱和生物活性分析表明 LeucinostatinA 的正确结构是前已经报道结构的差向异构体[47]。LeucinostatinA 的结构是当н 个颇具争议的焦点。

分子结构,鼠伤寒沙门氏菌,乙酰胆碱酯酶抑制剂,提取物

碱是指存在于生物体内的含氮碱性化合物，大多数有较为复杂的含氮环作用[48]。Teles 等[49]在淡紫拟青霉的生长期间添加有活性的鼠伤寒沙门氏射的鼠伤寒沙门氏菌和经高压灭菌失活的鼠伤寒沙门氏菌各 1 mL 或 10鼠伤寒沙门氏菌为对照，比较发现鼠伤寒沙门氏菌的大量添加产生的提寒沙门氏菌的小量添加可以产生有活性的提取物，щ淡紫拟青霉у少量的鼠伤寒沙门氏菌共培养时产生的提取物对乙酰胆碱酯酶的抑制率最高和质谱技术分析该提取物，得知添加 1 mL 经高压灭菌失活的鼠伤寒沙紫拟青霉产生种新的化合物 Paecilomide，它是乙酰胆碱酯酶抑制剂，碱。乙酰胆碱是种大脑神经传导物质，它的减少可引起老年痴呆症，作用于突出间隙，使乙酰胆碱减少，而乙酰胆碱酯酶抑制剂则有利于大积聚，可提高认知能力，改善行为和功能障碍，对老年痴呆症的治疗是

【参考文献】