拟态弧菌靶向DNA疫苗对肠巨噬细胞活性及抗原递呈相关基因转录的影响

发布时间：2020-07-13 03:24

【摘要】：拟态弧菌(Vibrio mimicus)是一种严重危害了水产养殖业的肠道病原菌。由于口服疫苗接种不受鱼体大小和养殖规模限制、易于操作,且诱导机体产生的肠黏膜免疫在抗该菌感染中发挥着重要作用。因此,研制安全、高效和可用于口服免疫的拟态弧菌DNA疫苗显得十分必要。口服或肛注免疫产生机制主要依赖肠黏膜免疫系统。尽管硬骨鱼类肠黏膜免疫系统中缺乏如哺乳动物的淋巴集结和树突状细胞,但在中后部肠段黏膜固有层中分布着大量免疫细胞。其中,肠巨噬细胞除具有呼吸爆发活性和吞噬杀伤功能外,还扮演着抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cell,APC)角色,在先天性免疫和获得性免疫之间发挥着桥梁作用。因此,鱼类肠巨噬细胞的活性、功能以及抗原递呈相关基因的转录水平是评价口服或肛注DNA疫苗诱导的免疫应答水平,尤其是肠黏膜免疫水平的重要指标,同时国内外关于鱼类体外肠巨噬细胞的研究甚少。本实验室前期研究中已构建了拟态弧菌“裸”DNA疫苗,在此基础上,本论文以大肠杆菌DH5α冻干菌影装载“裸”DNA疫苗构建靶向DNA疫苗,并检测其对草鱼肠巨噬细胞的活性、功能以及抗原递呈相关基因转录水平的影响。完成的主要研究工作和成果总结如下:1)大肠杆菌DH5α菌影的最佳裂解条件与装载条件优化。对初始浓度OD_(600nm)值分别为0.3、0.4、0.5和0.6的重组大肠杆菌DH5α(pBV220-LysisE)进行42℃诱导溶菌,通过比较重组菌的溶菌动力曲线、裂解效率及其形态结构特征,确定DH5α菌影最佳的裂解条件为选择起始浓度OD_(600nm)为0.4的DH5α(pBV220-LysisE)菌液在42℃诱导2.5 h。在最佳裂解条件下大量制备DH5α冻干菌影,探讨不同的冻干菌影、质粒和膜囊比例对装载量的影响,优化出三者比例为5:3:1时装载量最高。2)拟态弧菌靶向DNA疫苗的制备、免疫与转录表达检测。在最佳装载条件下以DH5α冻干菌影分别装载真核表达重组质粒pcDNA3.1-Ovepis(拟态弧菌“裸”DNA疫苗)和pcDNA3.1-Iclp-Ovepis(拟态弧菌内靶向DNA疫苗)制备出外靶向与双靶向DNA疫苗。以拟态弧菌三种靶向DNA疫苗和“裸”DNA疫苗肛注免疫草鱼,经RT-PCR检测发现疫苗基因于免疫后7、14和21 d在肝脏、头肾、脾脏和肠组织中均有转录表达。3)免疫前后肠巨噬细胞的活性/功能及其抗原递呈相关基因检测。于免疫后7、14和21 d分离培养草鱼肠巨噬细胞,分别采用NBT还原方法、Griess法、中性红法检测草鱼肠巨噬细胞的氧呼吸爆发活性、氮呼吸爆发活性及吞噬能力。结果显示,各检测时间点双靶向DNA疫苗组肠巨噬细胞的各项检测指标总体上优于2个单靶向DNA疫苗组;免疫后7和14 d,2个单靶向DNA疫苗组肠巨噬细胞的各项检测指标均优于“裸”DNA疫苗组。此外,以荧光定量PCR方法检测肠巨噬细胞中抗原递呈相关基因(MHC-Iα、MHC-IIβ、Iclp、STING)转录水平,发现各检测时间点双靶向DNA疫苗组肠巨噬细胞中MHC-Iα、MHC-IIβ和Iclp基因转录水平总体上高于单靶向DNA疫苗组和“裸”DNA疫苗组;四种DNA疫苗均能显著提高肠巨噬细胞中STING基因的转录水平,但各检测时间点组间差异无规律性。综上所述,拟态弧菌三种靶向DNA疫苗均能显著增强免疫草鱼肠巨噬细胞的活性/功能及其抗原递呈相关基因转录水平,且总体上以双靶向DNA疫苗的增强作用最好。
【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S941.42
【图文】：

结构图,结构图,α链,β链

图 1 MHC I 与 MHC II 类分子结构图 (引自张彦[25])Fig.1 Molecular structure of MHC I and MHC II ( Citing from ZhangYan[25])分子是一种异二聚体糖蛋白（由两条α链和两条β链组成），结构如图 1 右侧。由 MHC IIα基因表达出α链和 MHC I

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图 2 Ii 链分子结构图（引自王巧巧[43]）Fig.2 Molecular structure of the Ii chain (Citing from WangQiaoqiao[43])作用质网合成中，Ii 链合成数量是远大于 MHC II 类分子的。Gedde-Da

示意图,示意图,斑马鱼,同源基因

图 3 Ii 链与 MHC II 类分子结合示意图（引自王巧巧[43]）chematic diagram of binding of Ii chain to MHC class II molecules (Citing from WangQ定链类似蛋白的简介先是在斑马鱼体内被发现了鱼类恒定链同源基因[47]，由于对其

【参考文献】