基于人类全基因表达谱探讨肾精亏虚证“异病同证”的分子机制

发布时间：2020-07-13 07:33

【摘要】：目的:1.理论研究:肾藏精藏象理论是中医基础理论的重要命题,通过梳理肾藏精理论发展的历史源流,深刻认识肾藏精理论的历史渊源。肾藏精是肾的主要生理功能,基于肾藏精理论探讨“肾-骨-髓-脑”体系以及“肾精亏虚证”的理论基础。2.实验研究:通过人全基因组表达谱芯片高通量测序技术,筛选“异病”(老年性痴呆和原发性骨质疏松症)“同证”(肾精亏虚证)的差异表达基因,探讨肾精亏虚证的分子生物学机制,验证本研究的科学假说“肾精亏虚证的分子生物学机制可能与老年性疾病(原发性骨质疏松症和老年性痴呆)患者的人类全基因表达谱中差异表达的基因密切相关”,并探讨性别不同因素对于“肾精亏虚证”老年性痴呆和原发性骨质疏松症患者发病的影响,揭示“肾精亏虚”老年性疾病衰老机制的内在规律,丰富“肾藏精”理论的基本科学内涵。材料与方法:1.理论研究:通过阅读中医古籍,梳理“肾藏精”理论发展的历史源流,深入探讨“肾藏精主骨生髓”以及“肾精亏虚证”的理论基础。2.实验研究:(1)选择符合纳入标准的肾精亏虚证老年性痴呆组(AD group)16例、肾精亏虚证原发性骨质疏松症组(OP group)16例、同年龄段健康状态老年人对照组(control group)12例,三组均男女各半。(2)基于人全基因组表达谱芯片高通量测序技术,采用Affymetrix公司的Prime View?Human Gene Expression Array基因表达谱芯片检测三组人群外周血白细胞的基因表达谱。(3)通过比较肾精亏虚证AD组与对照组、肾精亏虚证OP组与对照组的基因表达谱,筛选差异表达的基因。(4)根据性别不同,分别比较男性和女性的肾精亏虚证AD组与相应性别的对照组的基因表达谱,筛选差异表达的基因,并进一步比较同病同证不同性别患者差异基因表达的特征。(5)根据性别不同,分别比较男性和女性的肾精亏虚证OP组与相应性别的对照组的基因表达谱,筛选差异表达的基因,并进一步比较同病同证不同性别患者差异基因表达的特征。(6)利用生物信息学方法,对筛选到的差异表达基因进行Gene Ontology(GO)功能富集分析和Pathway分析。(7)采用实时荧光定量PCR法(q RT-PCR)验证差异性基因。(8)进一步分析“异病”(老年性痴呆和原发性骨质疏松症)“同证”(肾精亏虚证)差异表达基因同源性。结果:1.“肾藏精”理论的历史源流:先秦时期是“肾藏精”理论构建形成的时期,秦汉南北朝时期是“肾藏精”理论传承发扬的时期,唐宋金元时期是“肾藏精”理论进一步发展充实的时期,明清时期是“肾藏精”理论日趋成熟完善的时期,近现代时期是“肾藏精”理论继承创新的时期。2.“肾藏精主骨生髓”理论是以肾所主形体为解剖形态基础,以精、天癸、元气、津液等为生命物质基础,以肾主蛰藏的生理特性为功能基础,以肾藏志为思维活动基础,以肾与膀胱、三焦、经络的联系为人体整体观基础,以肾与自然、社会的联系为天人一体观基础而形成的复杂而独特理论体系。3.“肾-骨-髓-脑”系统的建立是以“肾藏精主骨生髓”理论为基础,老年性痴呆和原发性骨质疏松症均以“肾精亏虚”为根本病机,属肾精亏虚证“异病同证”。4.肾精亏虚证老年性痴呆患者的差异表达基因:(1)与对照组比较,肾精亏虚证AD患者中特异性表达的探针有308个,对应247个基因(FC≥1.5,q-value≤5%),其中上调基因228个,下调基因19个。上调倍数超过3倍的基因有6个,分别是S100P、SAMSN1、CCL4、TNFAIP3、SDCBP、IL1B,下调倍数小于0.5倍的基因有3个,分别是CX3CR1、EGR1、FOS。经q RT-PCR验证,上调表达的6个基因与对照组比,表达水平具有统计学意义(p0.05);下调表达的3个基因与对照组比,表达水平具有统计学意义(p0.01)。(2)与对照组相应的人群比较,女性肾精亏虚证AD患者共有323个差异性表达探针,对应184个基因(FC≥1.5,q-value≤5%);男性肾精亏虚证AD患者只有33个探针呈现差异性,对应27个基因(FC≥1.5,q-value≤5%),其中二者显著共表达(FC≥3,q-value≤5%)的差异基因是:S100P(上调)。5.肾精亏虚证原发性骨质疏松症患者的差异表达基因:(1)与对照组比较,肾精亏虚证OP患者中特异性表达的探针有910个,对应602个基因(FC≥1.5,q-value≤5%),其中上调基因579个,下调基因23个。上调倍数超过3倍的基因有7个,分别为S100P、SNX3、DEFA1、MMP9、LTF、ANXA3、IL1R2;下调倍数小于0.5倍的基因有3个,分别为CX3CR1、SPON2、GNLY。经q RT-PCR验证,上调表达的7个基因与对照组比,表达水平具有统计学意义(p0.05);下调表达的3个基因与对照组比,表达水平具有统计学意义(p0.05)。(2)与对照组相应的人群比较,女性肾精亏虚证OP患者共有182个差异性表达探针,对应120个基因(FC≥1.5,q-value≤5%),男性肾精亏虚证OP患者共有138个差异性表达探针,对应118个基因(FC≥1.5,q-value≤5%),其中二者显著共表达(FC≥3,q-value≤5%)的差异基因是:SNX3(上调)。6.“异病”(老年性痴呆和原发性骨质疏松症)“同证”(肾精亏虚证)患者差异表达基因的同源性分析:与对照组比,肾精亏虚证OP和肾精亏虚证AD两组患者呈现131个共表达的差异基因(FC≥1.5,q-value≤5%),其中显著共表达的上调基因为S100P(FC≥3,q-value≤5%)、下调基因为CX3CR1(FC≥2,q-value≤5%)。男性、女性以及整个肾精亏虚证OP组患者分别与相应的肾精亏虚证AD组患者比较所筛选的三组差异表达基因中,三组都呈现上调表达的差异基因仅为TNFSF10,都呈现下调表达的差异基因仅为CCL4/CCL4L1/CCL4L2(FC≥2,q-value≤5%)。结论:1.“肾藏精”藏象理论是中华民族在长期保养生命、维护健康、与疾病做斗争的实践过程形成的,经过不断传承、发展、完善和创新,已成为独具特色的理论体系。“肾藏精主骨生髓”理论是“肾藏精”生理功能的重要组成部分。2.“肾-骨-髓-脑”系统的建立是以“肾藏精主骨生髓”理论为基础,老年性痴呆和原发性骨质疏松症均以“肾精亏虚”为根本病机,属肾精亏虚证“异病同证”。3.肾精亏虚证老年性痴呆患者呈现247个差异表达基因,其中显著表达的差异基因依次是S100P、SAMSN1、CCL4、TNFAIP3、SDCBP、IL1B、CX3CR1、EGR1、FOS;肾精亏虚证原发性骨质疏松症患者呈现602个差异表达基因,其中显著表达的差异基因依次是S100P、SNX3、DEFA1、MMP9、LTF、ANXA3、IL1R2、CX3CR1、SPON2、GNLY。对于同病同证患者,性别因素对基因表达的影响显而易见,提示体质(性别不同)因素对于疾病的影响客观存在。4.肾精亏虚证老年性痴呆和原发性骨质疏松症患者呈现131个共表达的差异基因,其中显著共表达的差异基因为S100P(上调)、CX3CR1(下调),说明“肾精亏虚证”的老年性疾病(老年性痴呆和原发性骨质疏松症)患者差异基因表达存在“个性”,同时也有“共性”,提示“肾精亏虚证”的分子生物学基础与此“共性”有关,而这一“共性”主要体现在干细胞及其微环境相关的基因表达异常。5.本研究提示我们:在临床实践中,对于“异病同证”不仅需要辨证求同,而且也需要辨病求异,并且要兼顾体质等因素对疾病的影响,进一步为未来精准“病证结合论治”提供宏观与微观依据。
【学位授予单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R223
【图文】：

散点图,差异表达基因,散点图,对照组

基于人类全基因表达谱探讨肾精亏虚证“异病同证”的分子机制实验结果患者的差异表达基因，肾精亏虚证 AD 组中特异性表达的探针有 308 个ue≤5%），其中上调基因 228 个，下调基因 19 个肾精亏虚证 AD 组的表达明显高于对照组（上调）的表达明显低于对照组（下调）。对差异表达的很好的区分肾精亏虚证 AD 组和对照组（图 2-1-2） 3 倍的基因有 6 个，分别为 S100P、SAMSN1、CCL42）；下调倍数小于 0.5 倍的基因有 3 个，分别为。

散点图,差异表达基因,聚类分析,倍数

倍数超过 3 倍的基因有 6 个，分别为 S100P、SAMSN1、CCL4、TNFAIP见表 2-1-2）；下调倍数小于 0.5 倍的基因有 3 个，分别为 EGR1、FO 2-1-3）。图 2-1-1 肾精亏虚证 AD 患者差异表达基因的散点图

生物学过程,分子机制,人类

-3生物学过程（BP）

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