鸭疫里默氏杆菌生物素合成相关基因bioF生物学特性分析及应用

发布时间：2020-07-16 11:03

【摘要】：鸭疫里默氏杆菌(Riemrella anatipestifer,RA)是一种主要感染鸭类、鹅类,造成感染动物发病,以心包炎、肝周炎为主要特征的一种接触性病原菌。感染鸭发病、死亡率可分别高达90%和75%,已经严重影响了养鸭业。生物素(Vitamin H或Co-R),作为生物体内关键酶的发挥活性所必须的辅因子,有着不可或缺的作用。主要包括:丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase,PC)和酰基辅酶A羧化酶(Acyl-CoA carboxylase,ACC)等,主要通过羧化、脱羧和转羧基的作用,参与到脂肪酸合成、糖异生以及氨基酸代谢等途径。生物体摄取生物素有两种途径,一种是通过自身合成,另一种是从外界环境中摄取。大多数微生物、植物以及真菌都通过第一种方式获得,而哺乳动物及人类则由于缺少合成生物素相关酶系,必须通过第二种途径获得。因此生物素的合成途径有可能成为研发新型抗菌素富有潜力的药物靶标。本研究从随机转座子突变库中筛选到一株生物素合成相关基因突变株,分析了该突变株的相关生物学特性,并对突变株的免疫效果作了评估。本研究包括以下2部分内容:一、前期研究中,我们发现bioF同源基因AS87_RS09170与RA毒力相关。在本研究中,通过序列分析表明,AS87_RS09170基因在RA中高度保守,该基因的编码产物8-氨基-7-氧代壬酸合成酶(AONS)具有保守的吡哆醛5'-磷酸结合中心。Western blot分析表明突变株Yb2ΔbioF的两种生物素依赖性酶的同工型比野生株Yb2的表达量显著降低,表明突变株Yb2ΔbioF生物素生物合成减少。生长曲线的测定表明,Yb2ΔbioF是一种生物素缺陷型菌株,其在对数生长期生长速率显著降低,在补充生物素的条件下,可以回复到野生株的水平。电镜观察显示突变株Yb2ΔbioF细胞外形不规则,含有多个牙生的赘生物,外膜凹凸不平,局部不规则增厚。与野生株相比,Yb2ΔbioF对鸭胚成纤维细胞的黏附入侵能力和生物被膜形成能力显著增强。此外,突变株Yb2ΔbioF感染雏鸭的血液载菌量显著低于相同剂量野生株感染雏鸭的载菌量,表明AS87_RS09170在RA感染雏鸭模型中建立全身感染至关重要。本研究首次证实RA生物素的生物合成与细菌生物学特性和致病性相关。二、本研究对突变株Yb2ΔbioF作为弱毒苗的免疫效果进行了评价。将突变株Yb2ΔbioF在TSB和TSA中连续交替传代30次,每隔10代对其菌株形态、生化反应特性、分子生物学特性以及对易感日龄樱桃谷鸭的致病性进行测定,结果显示Yb2ΔbioF在体外连续传代30次后各种特性均不发生变化,其毒力未见返强。取第30代菌液(Yb2ΔbioF-F30)感染18日龄樱桃谷鸭,感染后7天雏鸭精神状态、采食饮水、生活习性等均正常,剖检感染鸭未见心、肝、脾有任何眼观病变和组织学病变。运用突变株Yb2ΔbioF制备弱毒活疫苗免疫樱桃谷鸭,不仅能刺激机体产生较高水平的抗血清2型RA的特异性抗体,同时能刺激机体产生较高水平的Th1类与Th2类细胞因子,表明疫苗免疫后显著地引起了细胞免疫应答和体液免疫应答。攻毒保护试验结果显示,雏鸭经一次免疫和二次免疫后,均可获得较好的针对RA强毒攻击的免疫保护力,其中,雏鸭经一次免疫后对Yb2强毒攻击保护率为90%,经两次免疫后对Yb2强毒攻击保护率高达100%。本研究结果表明Yb2ΔbioF可作血清2型RA的弱毒活疫苗候选株。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.61
【图文】：

分枝杆菌,生物素,途径,壬酸

Fig 1.1 Putative biotin biosynthesis pathway in M. tuberculosis氨基-7 酮基壬酸合成酶（BioF）基-7 酮基壬酸合成酶（KAPAS）又叫做 BioF，是一种 5-磷酸吡哆醛（pyridoxal 5 赖性的转氨酶，主要功能是参与庚二酸单酰-CoA（或-ACP）的脱羧反应，然基壬酸（KAPA）(Lin and Cronan, 2011)。目前已有报道的 BioF 的同源结构通过与其他的已知结构的 PLP 依赖性酶的结构进行对比，发现 BioF 与二烷基构比较更为接近，因此判断 BioF 属于Ⅱ型转氨酶(Lin and Cronan, 2011)。芽孢杆菌中的 BioF 的催化机制是：ANOS 中的活性中心 Lys236 与 PLP 共价结胺(Alexeev et al., 1998; Webster et al., 2000)，然后与PLP结合，攻击底物庚二酸oA。除了 Lys236，活性位点残基 His133，Ser179，Asp204，His207 和 Thr233 也的活性位点。这些残基在所有物种的 BioF 都是高度保守的(Mann and Ploux, 8-二氨基壬酸合成酶（BioA）又称 7，8-二氨基壬酸合成酶（DAPAS）属于氨基转移酶家族(Schneider and化 SAM 的氮原子转移给 KAPA，最终成为生物素的 N7 分子。DAPAS 催化的图 1.1 分枝杆菌中生物素的合成途径

突变株,鸭疫

CR 扩增突变株 Yb2ΔbioF erm F _RS09170 基因片段；泳道 3：PCRrRNA 基因片段of mutant strain and complementatLane 1: The erm F and R. anatipestifefragment of ermF or a 496-bp fragme were amplified from the wild strain Ynt of RA 16S rRNA. Lane 3: The biotrain cYb2ΔbioF , showing a 1158-bfragment of RA 16S rRNA.列比对以及保守氨基酸的分析.2A），在NCBI中进行R鸭疫里图 2.1 鉴定突变株与回复

序列,保守性,菌株,血清

A: PCR 鉴定 bioF 的保守性 M：DNA Marker DM2000；泳道 1-5;血清 1 型菌株 GTB1、GTB2、CQ1、CQ3、NJ4；泳道 6-10：血清 2 型菌株 GDO-3、JY1、JY2、NJ3、SC2；泳道 11-15：血清 10 型菌株 GDO-1、HXb2、YXb1、YXb11、YXL1；泳道 16-20：血清 15 型菌株 SQ007、SQ003、SQ004、YGT002、马 001；泳道 16-20：未定型菌株 GDO6、GDO-、G46、G77、JY-6；泳道 26：阴性对照；泳道 27：阳性对照 Yb2B: 预测 bioF 编码蛋白 ANOS 与 PDB 中已知 ANOS 序列比对分析。从 Uniprot 数据库中检索已知 ANOS 晶体结构的序列。[伯克霍尔德氏菌(pdb5JAY)，假鼻疽杆菌(pdb4IW7)，大肠杆菌(pdb1DJE)，伯克霍尔德氏菌(pdb5VNX)，结核分枝杆菌(pdb3WY7)] C: bioF 多序列比对。所有序列中严格保守的残基用黑色框起来。形成保守的吡哆醛5'-磷酸结合口袋的残基用黑色倒三角（G97，Y98，N101，E168，D197，H200，T228 和 K231）表示。Fig. 2.2 The identification the conserved bioF genes(A)PCR identification the conserved bioF genes M: DNA Marker DM2000; Lanes 1-5; Serotype 1 strains GTB1, GTB2,CQ1, CQ3, NJ4; Lanes 6-10: Serotype 2 strains GDO-3, JY1, JY2, : Serotype 10 Strain GDO-1, HXb2, YXb1, YXb11,YXL1; Lanes 16-20: Serotype 15 Strain SQ007, SQ003, SQ004, YGT002, G46, G77, JY-6; lane 26: negative control;lane 27: positive control Yb2 strain.(B) Identity and divergence analysis of predicted ANOS from R. anatipestifer and other known 8-amino-7-oxononanoatesynthase. The crystallized 8-amino-7-oxononanoate synthase sequences [Paraburkholderia xenovorans (pdb5JAY),图 2.2 bioF 基因的保守性

【参考文献】