小尾寒羊ANKRD2基因的克

发布时间：2020-07-17 22:05

【摘要】：锚定重复蛋白(muscle specific ankyrin repeat proteins-MARPs)家族是由三个保守的成员组成:心肌锚定重复蛋白(Ankyin repeat domain 1,ANKRD1)、骨骼肌锚定重复蛋白(Ankyin repeat domain 2,ANKRD2)和锚定重复蛋白23(Ankyin repeat domain23,ANKRD23)。本试验根据实验室前期小尾寒羊和杜泊羊臂二头肌转录组测序数据,对两个转录本差异表达基因进行筛选,挖掘到差异表达基因ANKRD2为本研究的目的基因。ANKRD2基因特异性表达于骨骼肌,在骨骼肌生长发育过程中起重要作用,参与肌细胞的分化与肌纤维的形成和成熟。目前关于小尾寒羊ANKRD2的核酸序列、分子结构和组织表达尚未见报道。本研究克隆了小尾寒羊ANKRD2基因的全长cDNA序列并对其编码的蛋白进行了一系列的生物信息学分析,在mRNA水平和蛋白水平上对小尾寒羊和杜泊羊的组织表达进行了分析。主要研究结果如下:(1)小尾寒羊ANKRD2基因全长cDNA序列的克隆使用RT-PCR,5′RACE和3′RACE法,其全长1179 bp,包含990 bp的开放阅读框、21 bp的5′非编码区(5′UTR)和168 bp的3′非编码区(3′UTR)。其中,开放阅读框编码329个氨基酸的多肽链。我们克隆该基因并将其提交在Genbank上,登陆号是KR090892。在NCBI上下载该基因的预测序列,与我们克隆的序列进行比对,发现相似率约99.40%,CDS区存在2个碱基突变位点。(2)生物信息学分析显示,ANKRD2基因编码的蛋白分子量为36.7 kDa,脂溶指数为87.48(60),蛋白的流动性较大。不稳定指数为49.57(40),蛋白的稳定性一般。疏水性指数为-0.6,说明它为水溶性蛋白,且亲水性较好。等电点为5.72,为偏酸性蛋白,氨基酸组分最多的是谷氨酸。预测蛋白质的二级结构是α螺旋和无规则卷曲。生物信息学软件分析发现其C值、S值和Y值均小于0.5,推断其不含有蛋白信号肽,属于非跨膜蛋白,故不能被分泌到细胞外发挥作用。在氨基酸序列中,发现14个磷酸化位点,12个泛素化位点,10个糖基化位点,4个锚定重复结构域。利用Swiss-model软件预测发现模型ANK-N5C-317(4o60.1.A)与我们所研究的蛋白拥有最相似的三级结构。(3)将获得的小尾寒羊该基因编码的氨基酸序列与其他物种的氨基酸序列进行同源性分析,发现小尾寒羊ANKRD2氨基酸与所选物种的相似性均在86%以上,说明该蛋白在哺乳动物中高度保守,系统进化树分析发现绵羊的遗传距离与山羊、牛、马相距较近,与人类、猪、鼠、虎鲸的遗传距离相距较远。(4)通过荧光定量PCR和Western-blot技术分析该基因在小尾寒羊和杜泊羊不同的组织间的表达情况,发现该基因在小尾寒羊和杜泊羊中均呈现出组织表达差异性。研究发现该基因主要在小尾寒羊和杜泊羊的骨骼肌中表达,在骨骼肌中的表达量最高,显著高于其他组织(p0.05)。此外,在骨骼肌组织中,杜泊羊ANKRD2蛋白表达量显著高于小尾寒羊的(p0.05),在其他组织中,蛋白表达量无显著差异。综上所述,本研究从mRNA水平和蛋白水平对小尾寒羊ANKRD2基因展开了较为系统的研究,并且验证了小尾寒羊ANKRD2基因在小尾寒羊和杜泊羊不同组织中的表达情况,为地方品种小尾寒羊经济性状的改良和分子育种提供理论依据。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S826
【图文】：

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3 结果与分析3.1 克隆测序与核苷酸序列分析3.1.1 总 RNA 的提取试验采用琼脂糖甲醛变性凝胶电泳对我们前期提取的总 RNA 进行检测，检测结果如图 3-1 所示，电泳图显示我们提取的总 RNA 的 28 S 和 18 S 两条带清晰明亮，没有拖尾的现象，说明我们提取的总 RNA 的完整比较好，没有受到 DNA 或者蛋白质的污染，提取的 RNA 可以用于我们后续实验研究。使用核酸蛋白分析仪检测我们提取的总 RNA 的浓度和 OD 值，结果显示，提取的总 RNA 的浓度值为 262.3，OD 值为 1.96（1.8-2.0 之间），说明我们提取的总 RNA 的纯度比较较高，且没有受到蛋白质和 DNA的污染。

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山东农业大学硕士学位论文目的条带，我们获得一段 990 bp 的基因片段，测序序列与 GenBank 数据库提供羊 ANKRD2 基因预测序列的相似度在 99%以上，只有 2 个碱基存在不同。试验所的 DNAMarker 为 DL2000，条带从上到下一次为：2000 bp; 1000 bp; 750 bp; 5000 bp; 100 bp。

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图 3-3 骨骼肌锚定重复蛋白基因 3' RACE 扩增产物电泳图Fig.3-3 Agarose electrophoresis of extraction of Ankrd2 3' RACE3.1.4 ANKRD2 基因 5' RACE 扩增及其测序利用华大基因设计的特异性引物 5' I 与 5' O，以及 5' RACE 试剂盒内提供的 5RACE Outer Primer 与 5' RACE Inner Primer 进行巢式 PCR 反应，琼脂糖凝胶电泳检测发现我们扩增的产物大小与前期预计所应该获得的片段长度大体一致，由电泳图可知，没有非特异性引物和引物二聚体的出现通过上海生工科技有限公司测序，图 3-4 中最明亮的条带是我们克隆的目的条带，我们获得一段 203 bp 的基因片段。试验所选用的DNA Marker 为 DL 2000，条带从上到下一次为：2000 bp; 1000 bp; 750 bp; 500 bp; 250 bp100 bp。

【参考文献】