银屑病易感基因IL28RA对HaCaT细胞增殖和分化的影响及其分子机制研究

发布时间：2020-07-18 07:56

【摘要】：背景:银屑病是一种较为常见的慢性炎症性皮肤病,以皮肤鳞屑性红斑为主要临床表现,是遗传因素、环境因素和自身免疫共同相互作用结果,其易复发、难治愈,严重影响患者的身心健康。然而,银屑病确切的病因和发病机制至今仍未完全阐明是皮肤科领域亟待解决的难题之一。目前认为银屑病的发病机制是T细胞和树突细胞活化,炎症髓样树突状细胞释放IL-23和IL-12以活化产生IL-17的T细胞,Th1细胞和Th22细胞以产生大量的银屑病细胞因子IL-17,IFN-γ,TNF和IL-22,这些细胞因子又作用于角质形成细胞以加重银屑病炎症,最终导致角质形成细胞的增殖、分化、凋亡异常,形成了临床可见的银屑病特征性皮损。全基因组关联分析研究成为发现复杂疾病易感基因最常用的方法之一。GWAS发现大量的银屑病易感基因,其中具有免疫功能的IL28RA基因为中国汉族人银屑病和系统性红斑狼疮的易感基因,也是欧洲人群银屑病的易感基因。由该基因编码的蛋白质属于II类细胞因子受体家族,位于染色体1p36.11,由9个外显子编码蛋白质。目前研究较多是IL28RA与IL10Rβ形成受体复合物,再与三个密切相关的细胞因子IL-28A,IL-28B及IL-29相互作用发挥抗病毒、抗增殖的作用,IL28RA基因在银屑病中发病机制研究国内外还尚未见报道。银屑病是人类特有的疾病,所有的动物银屑病模型都是模拟人类银屑病的近似情况。实验局部应用TLR7/8激动剂咪喹莫特引起小鼠银屑病样皮肤炎症来模拟人类银屑病模型。该模型模拟银屑病发病机制中关键部分,包括浆细胞样树突状细胞的激活和对Th17细胞的依赖。目的:本研究构建体外IL28RA过表达和低表达细胞模型检测其对人类永生性皮肤角质细胞系(HaCaT)的增殖,分化影响及参与其中的信号通路,试图阐明IL28RA基因在HaCaT细胞中的作用机制,推测它在银屑病皮损形成及其在银屑病发病机制中的作用。本实验构建低剂量咪喹莫特诱导银屑病样皮损增厚的小鼠体外模型,检测细胞因子mIL-28A对小鼠皮损作用效果。方法:本实验利用免疫组化和Western Blot方法检测10例银屑病患者非皮损和皮损中IL28RA蛋白表达差异;脂质体LIP3000介导的cDNA稳定转染HaCaT细胞构建稳定IL28RA过表达,低表达及其对照的空载细胞系。MTS方法检测细胞增殖、伤口愈合实验检测细胞迁移能力;Western Blot方法检测细胞周期蛋白(CyclinB1和CyclinE)和分化蛋白(Involucrin和Loricrin)表达;流式细胞仪检测细胞周期分布;由于IL28RA和IL10R?组成受体复合物,因此加入配体IL-29刺激后再检测其增殖、细胞周期蛋白、细胞周期、分化蛋白的表达及检测参与增殖和分化的信号通路;Real-time PCR检测分化标志物mRNA的表达水平;低剂量咪喹莫特(1.56 mg/只)诱导小鼠皮损呈现银屑病样增厚,用等剂量咪喹莫特与mIL-28A(100 ng/μl)均匀混合涂抹小鼠背部,连续一周涂抹后处死小鼠。取背部皮做HE染色观察其病理形态学和Western Blot检测各组小鼠背部皮肤中IL28RA的表达。结果:与患者正常皮肤表达相比,IL28RA蛋白在银屑病患者皮损中低表达;和转染对照相比,IL28RA基因过表达能下调周期蛋白CyclinB1和上调CyclinE表达,加入IL-29(100 ng/ml)刺激结果显示IL28RA过表达分别下调CyclinB1和上调CyclinE;MTS检测细胞增殖和伤口愈合实验检测细胞迁移能力显示IL28RA基因过表达抑制HaCaT细胞增殖,抑制细胞迁移;和对照细胞相比,低表达IL28RA促进细胞HaCaT增殖,加快细胞迁移;加入IL-29(100 ng/ml)刺激,IL28RA基因过表达受到抑制较对照组细胞增殖抑制显著;IL-29(100ng/ml)刺激后对细胞伤口愈合实验无明显影响;流式细胞仪分析发现IL28RA基因过表达使细胞周期阻滞在S期,加入IL-29(100 ng/ml)刺激后,细胞抑制在G2/M期;IL-29(100 ng/ml)加入通过激活JAK-STAT信号通路抑制HaCaT细胞增殖,上调磷酸化STAT1;特定的抑制剂JAKI能抑制JAK-STAT信号通路;和对照细胞相比,IL28RA基因过表达上调角质细胞分化标志物(Involucrin和Loricrin)表达,而IL28RA基因低表达下调角质细胞分化标志物(Involucrin和Loricrin)表达。IL-29(100 ng/ml)通过激活JAK-STAT信号通路抑制钙离子诱导角质细胞分化标志物mRNA的表达。HE染色结果显示:对照组小鼠相比,低剂量咪喹莫特(1.56 mg/只)诱导小鼠皮损呈现银屑病样增厚;低剂量咪喹莫特(1.56 mg/只)与mIL-28A(100 ng/μl)均匀混合使皮损增厚显著,提示mIL-28A处理加重了小鼠皮损炎症。Western Blot检测与凡士林对照组小鼠皮肤相比,IL28RA蛋白在低剂量咪喹莫特处理组与mIL-28A混合处理组小鼠皮损中呈现低表达;结果提示这与IL28RA在人类银屑病中表达相类似。结论:IL28RA蛋白在银屑病患者皮损中低表达,提示其异常表达可能与银屑病角质形成细胞过度增殖和分化过程相关;体外实验证明IL-29细胞因子通过IL28RA受体复合物激活JAK-STAT信号通路抑制HaCaT角质细胞增殖和分化。mIL-28A与低剂量咪喹莫特混匀涂抹显示mIL-28A会加重小鼠皮损的炎症,促进小鼠银屑病样皮损形成。因此,我们推测IL28RA易感基因可能参与中国汉族人群银屑病发病机制,IL28RA可以作为一个潜在的分子靶点,为银屑病的治疗提供新的方向。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R758.63
【图文】：

质粒载体,结构模式

图 1. pCMV6-Entry 质粒载体结构模式图Fig1. The structure of pCMV6-Entry plasmid1）质粒的转化-80℃取 40 μl DH5α 感受态细胞悬液，室温解冻后立即置于冰上。 1.5 ml 的 EP 管中。编号 1，2 号。往 1 号管加入 1 μl 重组体 IL28RA-p务必离心，并加入 50 μl 的 TE 溶解)，1 μl 空质粒 pCMV6 分别与胞混匀，冰上放置 30 min。42℃水浴锅中热击 90 秒，热击后迅速置n。接着向管中加入 1 ml LB 液体培养基,混匀后 37℃震荡培养 1 小正常生长状态，并表达质粒编码抗生素基因。将上述菌液摇匀后取转移至 1.5 ml 离心管中离心，上清扔掉，余 100 μl 混匀）涂布于的筛选平板上，正面放 30 min,待菌液被培养基吸收完成后倒置培养-24 小时。

蛋白,患者,正常皮肤,标尺

图 2. IL28RA 蛋白在患者正常和皮损组织中的表达。(A) Western Blot 分析 IL28RA 蛋白在正常皮肤和银屑病皮损表达(n=10)（左）和各组相对 IL28RA 蛋白水平的定量（右），** P <0.01；(B) 免疫组化染色检测 IL28RA 蛋白(a, c)和阴性对照(b, d)表达，标尺=20 μm。实验至少重复三次，t-test 用于检验，与正常对照组相比，**P <0.01。Fig2. Expression of IL28RA protein was examined in normal skin and lesions of patients withplague psoriasis. (A) Western blot analysis of the expression of IL28RA in in normal skin andlesions of patients with plague psoriasis (n=10) (left) and quantification of relative IL28RA proteinlevel in each group (right), ** P <0.01, compared with control group. (B) The expression of IL28RAin in normal skin and lesions of patients with plague psoriasis by IHC staining (a, c) and negativecontrol (b, d). Scale bars = 20 μm. A t-test was performed. Data shown were the mean ± SD andrepresentative of at least 3 independent experiments. **P <0.01 compared with control group.

测序,质粒,过表达,安徽医科大学

安徽医科大学博士学位论文4.2 质粒成功转染 HaCaT 细胞验证4.2.1 pCMV6 对照质粒和过表达 IL28RA 质粒扩增将 pCMV6 对照质粒和过表达 IL28RA 质粒分别通过转化实验，转入感受态细胞中，摇菌，通过挑取单克隆扩大培养，提质粒，测序，经过 Blast 比对，与原来质粒序列相同。

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