泥鳅补体C3基因的克隆与表达分析

发布时间：2020-07-18 10:43

【摘要】：泥鳅是东亚国家,最重要的经济养殖鱼类之一。随着泥鳅养殖业的快速发展,由病原导致的感染性疾病越来越严重,尤其是细菌性疾病,这给我国的泥鳅养殖户造成了巨大的经济损失。然而,现在对泥鳅抗细菌感染的免疫机制的研究却并不是很多。补体系统是机体很重要的免疫防御系统,而补体C3是补体系统3条激活途径的一个中心分子,这3条激活途径最终都会回归到C3转化酶的形成,和共享最后的终末溶解途径。本论文利用分子克隆的方法对泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)补体C3基因进行了克隆与鉴定,构建了补体C3基因的系统进化树,分析了补体C3基因的m RNA在不同组织中的表达水平。并且在此基础上,构建了嗜水气单胞菌浸泡感染泥鳅的模型。用苏木精/伊红染色(HE染色)呈现了皮肤和鳃在感染以后的形态变化规律,用q PCR分析了泥鳅补体C3基因和其它9种补体相关基因在感染以后m RNA的表达规律,并以此构建了基因表达的热图。1.利用实验室已经获得的泥鳅转录组数据库比对分析,经过PCR验证发现了在泥鳅中存在3种C3亚型,分别命名为C3-1、C3-2和C3-3。克隆出了泥鳅C3-1的全长c DNA序列。C3-1 c DNA序列由4509 bp核苷酸组成,预测编码1454个氨基酸。C3-1的氨基酸序列中存在对C3功能非常重要的保守结构域。并且还在C3-1的氨基酸序列中发现典型的硫酯键序列(GCGEQ)存在一个氨基酸的突变。补体C3的系统进化树显示泥鳅补体C3-1与鲤科鱼类的补体C3亲缘关系较近。检测了3种C3亚型mRNA在肾脏、眼睛、脾脏、性腺、心脏、鳍条、肠道、肌肉、大脑、鳃、皮肤、血液和肝脏中的表达情况。发现C3-1和C3-3的表达模式类似,主要在肝脏中表达,然后是脾脏和性腺。然而,C3-2 m RNA的表达却与C3-1和C3-3有所不同。C3-2主要在肾脏中表达,然后是血液和性腺。2.用1×10~7CFU/ml的嗜水气单胞菌浸泡感染泥鳅,研究发现泥鳅在受到嗜水气单胞菌浸泡感染以后,它的皮肤和鳃会有一个很明显的形态变化。与对照组相比,泥鳅的次级鳃丝会变得又短又宽,而皮肤的表皮层也会有一个明显的变宽。3.用1×10~7CFU/ml的嗜水气单胞菌浸泡感染泥鳅,研究发现泥鳅在受到嗜水气单胞菌浸泡感染以后,C3-1和C3-3基因的m RNA的表达规律在鳃和皮肤中类似,分别在鳃的36 h和皮肤的24 h有一个显著的上调表达。而C3-2在鳃和皮肤中达到上调表达峰值的时间点都是感染以后48 h。在感染以后,3种C3亚型m RNA的表达在肝脏和脾脏中的表达都呈现出了一个很明显的上调趋势。同样的,我们也检测了一些补体调控相关的基因表达,BF、C1qb、C2b、C3aR、C3b、C4、C5、C8b和MASP-1。发现大多数补体相关基因的表达在鳃、皮肤和肝脏中也出现了一个上调的趋势,只是上调的倍数有所差异。本研究是第一次在泥鳅中报道存在3种C3亚型,并且首次克隆出了泥鳅补体C3-1的全长c DNA序列。3种C3亚型在许多组织中都有所表达,只是表达水平有所差异。泥鳅在受到嗜水气单胞菌感染以后,皮肤和鳃会有一个很明显的形态变化。而感染实验也可以造成3种C3亚型和其它补体基因在鳃,皮肤和肝脏中的表达上调。综上所述,我们的研究暗示着补体C3可能在黏膜组织抗细菌感染的过程中,发挥了一个重要的作用。本研究的结果同样也可以为后续补体C3的功能研究提供一个很坚实的基础。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4
【图文】：

后口动物,系统进化树,经典途径

图 1-1. 后口动物的系统进化树 (Nonaka, 2001)Fig.1-1. Phylogenetic tree of deuterostomes (Nonaka, 2001)1.1.1 经典途径经典途径可以被抗原抗体复合物激活。抗体（IgG 或者 IgM）的 Fc 片段和补体 C1 的 C1q 部分相结合，从而激活了 C1s 和 C1r,C1s 能够将 C4 酶解成 C4b和 C4a, C4b 可以通过硫酯键与抗原微生物结合。然后 C2 从而与 C4b 结合，与C4b 结合的 C2 从而被 C1 酶解成 C2a 和 C2b。C2a 继续与 C4b 结合形成经典途径的 C3 转化酶（C4b2a）。C4b2a 可以将天然的 C3 酶解成 C3a 和 C3b，而 C3b与 C4b2a 结合又可以生成经典途径的 C5 转化酶（C4b2a3b）(PangburnandRawal2002)。而C4b2a3b可以将C5裂解成C5a和C5b,而C5b是攻膜复合体（MembraneAttack Complex, MAC）的起始成分。C5b 与补体成份 C6-C9 在靶细胞膜上相互作用形成 MAC，导致靶细胞溶解 (Zhu et al., 2005)。

补体系统,激活途径,转化酶

但当机体识别出入侵的病原体或外源异物的表面蛋白质时，C3b 就会与 Bf 以非共价键的形式结合，此时 Df 激活 Bf，并使其酶解成 Ba 和 Bb，其中的 Bb 和 C3b 相互结合形成 C3 转化酶（C3bBb），此 C3 转化酶能将机体内原本非活化的 C3 大量酶解成 C3a 和 C3b，其中 C3b 和 C3 转化酶结合而形成关键因子 C5 转化酶（C3bBb3b）,进而形成 MAC 发挥作用。1.1.3 凝集素途径凝集素途径类似于经典途径，它需要凝集素，比如甘露糖结合凝集素（MBL）或者纤维胶原素，与微生物表面的含糖聚合物相互作用才能被激活 (Fujita et al.,2010)。当凝集素和微生物表面的含糖聚合物结合以后，MBL 相关的丝氨酸蛋白酶（MASPs）被激活。这些酶蛋白在结构上已经被证实类似于 C1r 和 C1s (Simand Laich, 2004)。因此，此复合物与经典途径中的 C1s 和 C1r 功能相似，将 C2和 C4 裂解后再相互结合形成 C3 转化酶，进而导致终末溶解途径的形成。

功能图,补体系统,功能,巨球蛋白

图 1-3. 补体系统的激活以后的功能 (Boshra et al., 2006)Fig.1-3. The function of complement system (Boshra et al., 2006)1.3 补体组成成分补体激活是一个级联放大的过程，这个过程复杂而又精密，并且有许多补体分子参与其中。有许多分子都有相似的特点，并且这些分子被认为是同一个基因的复制产物。举个例子，我们通常认为 C3，C4 还有 C5 是起源于同一个祖先基因，这个祖先基因最有可能是血浆蛋白酶抑制剂α-2 巨球蛋白，这个蛋白目前仍然存在于无脊椎动物中。α-2 巨球蛋白是从何时演变成 C3，C4 和 C5 这三种补体蛋白的，至今仍不清楚 (Zarkadisetal.,2001a)。现在已经从许多种无脊椎动物中分离出了与补体 C3 高度类似的分子 (Smith et al., 1999)，这说明 C3 的出现是早于 C4 和 C5 的。另外 C1s/C1r/MASP，Bf/C2，C6/C7/C8/C9 都被认为具有共同的起源。

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