大豆开花调控基因GmFT1a的克隆和功能研究

发布时间：2020-07-20 18:29

【摘要】：大豆(Glycine max(L.)Merr.)是典型的短日作物,光周期反应较为敏感。对晚熟品种(如自贡冬豆)而言,短日照是其开花和成熟的必要条件,连续的短日处理会显著加快开花和成熟;对经过一定日数短日诱导、已经开始生殖发育的植株进行长日处理,可以解除短日效应,使顶端分生组织从生殖器官分化回复到营养器官分化状态,发生开花逆转。上述现象说明,在大豆生长发育过程中,长日也有其独特的生理效应,且可能诱导产生某些开花抑制物质。Flowering Locus T(FT)是植物开花途径中的信号整合基因。在大豆中,已发现10个FT同源基因,其中,GmFT2a和GmFT5a是在短日条件下高效表达的开花促进基因,而GmFT4在长日条件下高效表达,在拟南芥中的异位表达导致了开花时间的延迟,说明大豆的FT基因功能可能存在分化,但在大豆FT基因家族中是否存在其它开花抑制基因仍不明确。本研究利用所在实验室多年研究建立的自贡冬豆开花逆转系统,对大豆中的10个FT同源基因进行了表达模式分析,筛选到了3个在长日条件下高效表达的FT基因:GmFT1a、GmFT1b和GmFT4。对从自贡冬豆中克隆得到的GmFT1a进行的系统研究表明,长日照下该基因在叶片中的表达量高于短日,且在维管组织中有较高的表达量。该基因编码的蛋白质定位于细胞质和细胞核。对不同品种中GmFT1a表达模式的比较发现,GmFT1a在黑河27等早熟品种中的表达量较低,而在晚熟品种中的表达量相对较高。不论品种光周期敏感性如何,GmFT1a在长日条件下的表达量均高于短日条件,与GmFT2a/GmFT5a的表达模式相反。分别利用E1近等基因系和E1过表达材料初步研究了GmFT1a表达量与大豆生育期重要调控基因E1的关系。结果表明,在E1近等基因系中,当E1为显性时,GmFT1a表达量相对较高;E1的过表达使GmFT1a的表达量上升。通过双荧光素酶检测发现,E1增强了GmFT1a CDS区上游序列驱动的LUC报告基因的活性。在该基因本底表达量较低的中熟品种Jack中过表达GmFT1a时,GmFT2a的表达量明显降低,开花期和成熟期明显延迟,营养生长和生殖生长的并行期延长,且在短日条件下产生更多的节数。对GmFT1a过表达材料进行转录组分析发现,一系列与开花相关的基因表达量发生变化。基于本研究并结合前人研究,提出了调控大豆生长发育的跷跷板模型(Teeter board model):大豆FT基因家族存在明显的功能分化,可分为开花促进基因(包括GmFT2a、GmFT5a等)和开花抑制基因(如GmFT1a、GmFT4)两类,二者通过表达量的相对变化影响大豆生长发育的方向。综上所述,大豆FT同源基因存在明显的功能分化,开花促进基因和抑制基因的平衡状态决定大豆生长发育的方向。GmFT1a的发现为大豆生育期性状的调控提供了新的分子工具。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S565.1
【图文】：

氨基酸序列,蛋白质,抑制基因,红色

图 3.6 大豆和其它物种中已知功能的 FT 氨基酸序列比对蛋白名称中：绿色阴影表示开花促进基因编码的蛋白质；红色阴影代表开花抑制基因编码的蛋白质；蓝色框代表External Loop；红色方框代表 VYN triad；红色三角形表示 GmFT1a 中可能的差异位点。Figure 3.6: Sequence comparison of known FTs in soybean and other speciesThe protein name with a green or red shadow means it is a flowering-promoting FT or a flowering-inhibiting Frespectively; The blue and red box represent a 14-amino-acid external loop and a 3-amino-acid triad respectively; The retriangles represent the amino acid residues 131, 134 and 135 in GmFT1a which are different from thflowering-promoting FTs in soybean or other species.3.3.2 GmFT1a 的亚细胞定位3.3.2.1 融合表达载体 p16318-GmFT1a 的构建根据含有 XbaI, SacI 酶切位点的引物，扩增得到含有该酶切位点，且不含终止密码子的GmFT1a 产物，连接 PLB 载体后，通过菌液 PCR 筛选阳性转化子测序。提取原始质粒 p16318 和PLB-GmFT1a，并将二者分别进行 XbaI、SacI 双酶切（图 3.7 A, B），电泳检测后回收 p16318 载

植株,子叶节,根部

获得了根部过量表达 GmFT1a 的复合体植株（图4.12），将子叶节下的主根剪下后，将其与对照组植株共同在短日条件下培养进行后续实验。图 4.12 复合体植株的获得A：子叶节注射；B：子叶节处出现瘤状突起； C：子叶节处长出发状根后将主根剪去。Figure 4.12 Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root transformationA: The unfolded cotyledons were injected with K599 strain containing 35S::GmFT1a by stabbing at their cotyledonarynode several times with a syringe needle. B: The nodular texture emerging at the stabbing position. C: Removing themain roots after the hairy-roots emergence.4.3.4.2 根部过量表达 GmFT1a 对植株开花和成熟的影响在植株培养的过程中，我们发现实验组中部分材料的开花有所延迟，对所有植株进行统计分析发现，相比对照组，当 GmFT1a 在根部过量表达时，植株有延迟开花的趋势（图 4.14 A, B）。随机选取部分植株取其根部，提取根部 RNA 后反转录，进行 GmFT1a 表达量的测定，发现一部分植株根部 GmFT1a 的表达量高于对照，而有一部分植株根部的表达量并没有明显的升高（图4.13）。

相关系数,样品,两个转化,野生型

86图 5.1 样品之间的 pearson 相关系数Figure 5.1 Pearson correlation between samples5.2.3 各转化株系中的差异基因数目比较为了分析两个转化株系表达谱的变化，对两个转化事件的差异基因的表达水平（log10(FPKM+1)值），做层次聚类(hierarchical clustering)分析。通过图 5.2 A 发现，转基因植株与野生型植株基因表达差异较大，而两个转化事件相比于野生型，差异基因上调和下调的趋势相同（图 5.2A）。转化事件#10 （T10）相比于野生型有 3120 个差异基因，其中上调基因 1426 个，下调基因 1694 个（图 5.2 B）；而转化事件#9（T46）相比于野生型仅有 670 个差异基因，其中上调基因 224 个，下调基因 446 个（图 5.2 C）。韦恩图显示，转化事件# 9 的 670 个差异基因中 90.4%（606 个）的差异基因都包含于 T10 的差异基因中（图 5.2 D）。

【相似文献】