牡蛎疱疹病毒感染魁蚶转录组测定及免疫相关基因分析

发布时间：2020-07-20 20:01

【摘要】：魁蚶(Scapharca broughtonii)又称大毛蛤、赤贝、血贝,隶属软体动物门、瓣鳃纲、翼足亚纲、蚶目、蚶科、毛蚶属。主要分布于西太平洋日本、韩国、中国沿海及俄罗斯东南部沿海。在中国,北起鸭绿江,南至广西均有分布,其中以辽宁、山东资源最为丰富。多栖息在3~50米水深处,是一种营埋栖生活的冷水性大型双壳贝类。魁蚶是一种优质的高蛋白、低脂肪食品,其营养价值高,味道鲜美,具有良好的市场前景和开发利用价值。但随着增养殖规模的不断扩大,其病害问题日益显著。2012年、2013年大连、山东多处育苗场暴发魁蚶种贝大规模死亡事件,本实验室从患病魁蚶体内分离出一种球形病毒,通过测序比对,证明其为牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)。为探明OsHV-1对魁蚶的致病性,本研究使用患病魁蚶组织制成病毒悬液进行感染实验。感染实验分为空白组,阴性悬液注射组和病毒悬液注射组,并使用实时定量PCR法对感染后魁蚶体内病毒的时空分布进行检测。实验结果表明,空白组和阴性悬液组魁蚶感染后未检测到病毒粒子,病毒悬液注射组魁蚶经人工感染后,各部位组织中病毒含量都呈先上升再下降随后又上升的趋势,最终达到106拷贝/ng DNA左右。通过电镜观察,在感染魁蚶的鳃、肝胰腺、外套膜中出现细胞核染色质边缘化甚至消失,细胞核肿胀、溶解,核仁消失,核膜扩张、不清晰,线粒体肿大,脊崩解,核糖体脱落等一系列细胞病理变化。在其细胞核和细胞质中均能发现大量直径为90~110nm球形病毒粒子,该病毒粒子具囊膜,囊膜内可见均匀的高电子密度的核衣壳,与自然患病魁蚶负染电镜中的病毒粒子形态相同。研究结果表明,OsHV-1可以感染魁蚶并与魁蚶大规模死亡有直接相关关系。目前针对该病毒的致病性、流行规律已经开展了相关研究,但是对于该病毒与魁蚶宿主间的相互作用机制的了解还很有限。本研究分别利用第三代测序技术PacBio RSII平台和第二代测序技术Illumina MiSeq平台构建魁蚶转录组文库。三代测序数据采用SMRT-Analysis Pipeline对所得序列进行分析,质控后共获得85,127条reads,其中有46,265条全长cDNA转录本,全长read平均读长为51,903bp。以魁蚶三代转录组测序组装结果为参考序列,采用Trinity v2.1对所得序列进行de novo拼接,共获得unigenes(200bp)276,997条,N50长度为1.35kb,平均长度508bp。对拼接结果进行注释,共74,529条序列获得GO号。用二代测序结果对魁蚶转录本进行基因差异表达分析,获得差异基因2998个,上调基因933个,下调基因2065个,筛选得到免疫相关基因1585个,主要包括热休克蛋白基因、信号转导基因、细胞凋亡基因以及细胞因子。本研究利用三代测序得到的全长转录本对其中的khHSP70、khHSP90、khHbI、kh HbIIA、khHbIIB等免疫相关基因进行了序列和结构分析,并且在魁蚶感染OsHV-1后其表达量均明显上调,证明其参与了魁蚶对OsHV-1的免疫反应。
【学位授予单位】：大连海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S944.44
【图文】：

流程图,转录组,测序,流程

对基基因组织要可分为基因功能进行织表达谱分析为 4 类（图 1行注释，GO 富析，基于转录1-1）。富集分析，Pa录因子分析基athway 富集分基因调控网络分析，转录组络等[7-9]。目前组表达谱分析前，转录组研析，蛋白互作研究技术根据作网络据原理

流程图,论文,技术路线,流程图

论文技术路线流程图

魁蚶,边缘化,腺管

图 2-2 魁蚶感染 OsHV-1 后的显微图片（a）PCR 检测为 OsHV-1 阴性的正常魁蚶肝胰腺的腺管；（b）感染魁蚶肝胰腺细胞破碎，腺管崩解；（c）感胞核固缩，P 为核固缩；（d）感染魁蚶消化腺细胞中染色质边缘化，M 为染色质边缘化，P 为核固缩。Fig.2 photomicrographsof OsHV-1 infected tissues fromScapharca broughtonii.(a)arious degrees of vacuolization observed in normal digestive tubules of a S. broughtonii tested negative for OsHVPCR; (b) lysed connective tissue and tubule dilation observed in infected S. broughtonii; (c) karyopyknosis in ibroughtonii, P= Pycnosis; (d) abnormal nuclear features in in the digestive gland of a S. broughtonii infected with Osnuclear margination, P= Pycnosis.3.6 感染魁蚶电镜观察结果用患病魁蚶制备的病毒悬液进行负染电镜观察，发现直径为90~110nm的病毒粒子，病毒近似

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