棉花调控细胞核内复制基因GaTOP6B在耐干旱胁迫中的功能研究
发布时间：2020-07-21 15:15
【摘要】：植物在生长过程中,基因组不断复制但不进行有丝分裂而导致细胞倍性水平升高的过程称为核内复制。核内复制通过细胞、代谢和遗传效应在生理及发育过程中起重要作用。干旱被认为是导致全球作物产量大幅减少的不利条件之一,因此鉴定出调节抗旱性相关的新型遗传因子可能是提高作物生产力的先决条件。与其他常见作物相比(如小麦和玉米等),棉花被认为是一种适应干旱胁迫先驱作物,这在一定程度上为我们提供了一个极好的模式植物,来描述植物中调节耐旱性的潜在新基因。在本研究中,我们从亚洲棉中发现了编码DNA拓扑异构酶ⅥB亚基的GaTOP6B基因,其参与调控细胞的核内复制过程,同时还影响植物对干旱的响应。本实验中使用了病毒诱导基因沉默(ⅥGS)技术降低亚洲棉中GaTOP6B的表达,还通过花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子驱动GaTOP6B在拟南芥中超表达,分析GaTOP6B对细胞核内复制和植物耐旱性的潜在影响。结果如下:1、从亚洲棉分离出AtTOP6B同源基因并命名为GaTOP6B。GaTOP6B的ORF长2010 bp,编码669个氨基酸。其蛋白序列含有GHKL、H2TH和Transducer三个高度保守的结构域,除棉属外,与可可、长果黄麻在进化上亲缘关系最近。2、在亚洲棉的根茎叶中均有GaTOP6B基因的表达,叶中的表达量最高。洋葱表皮的亚细胞定位显示GaTOP6B定位于细胞核上。3、将亚洲棉中GaTOP6B基因通过ⅥGS技术降低表达量后,植株表现出矮小的症状。流式细胞术检测显示其核内复制水平降低并伴随着核体积的减小。此外,断水20天后,GaTOP6B沉默的亚洲棉叶片表现出更加萎蔫的状态,其脯氨酸、叶绿素含量及抗氧化酶活性降低,丙二醛含量增加,气孔开度较大并伴随着较低的叶片相对含水量和较高的失水率。胁迫相关基因P5CS,RD22,DREB1A,NCED3的表达水平降低。4、超表达GaTOP6B的转基因拟南芥与野生型相比有着较高的生长活性。流式细胞术检测显示其核内复制水平较高并伴随着核体积的增大。断水14天后,转基因拟南芥萎蔫症状不明显,其脯氨酸含量较野生型拟南芥高。气孔先于野生型拟南芥闭合并伴随着较高的叶片相对含水量和较低的失水率。胁迫相关基因RD29,NCED3,COR15A,DREB1A的表达水平升高。5、超表达GaTOP6B的转基因拟南芥叶片的转录组数据显示,与野生型拟南芥相比,转基因拟南芥中的基因有着较高的转录活性。在200 mM的甘露醇处理后,转基因拟南芥中的差异基因主要与代谢相关,其编码蛋白质并在胁迫耐受中起作用,包括植物防御素、细胞壁生物合成、海藻糖生物合成和谷胱甘肽代谢等,通过诱导生理、生化如增强的防御、细胞壁增厚、渗透调节和清除ROS来提高转基因拟南芥的耐旱性。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S562
【图文】：
复制制又称为核内再复制，是多细胞真核生物的一种细胞周包括完整的基因组复制（S 期），但缺乏 M 期的染色体分 期特异性特征[1, 2]，细胞不断重复地复制其 DNA 而跳过胞质分裂，最终导致细胞的多倍化（图 1）[3]。核内复制控，从而有助于植物器官生长并促进植物产量[4]。细s）与细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）的复合物活性是转换[5]。为了结束有丝分裂进程并进入核内循环，一些 C必须下调，这个过程在真核生物中是非常保守的[2, 6]。会导致细胞基本特性的变化（如细胞增大和细胞得快速在植物体的生长发育和生理过程中有着重要的作用[8, 9]。数量的增加，特定细胞的代谢需求可以通过增加基因组如通过全基因组表达增加或者通过代谢途径中基因的差制在细胞分化或适应胁迫中同样发挥着重要的作用[10]。
图 2.1 GaTOP6B 的 cDNA 部分片段克隆（A）和 GaTOP6B 的 ORF 全长克隆（B）.3.2 基于 VIGS 系统 pTRV2-GaTOP6B 和过表达 pCAMBIA1300-GaTOP载体的构建将PCR扩增产物经电泳跑胶检测表明目的片段均已克隆出来（图2.2A和目的片段切胶回收后由上海生工生物公司测序后经比对确认扩增片段为构体所需要的片段。将目的片段与载体连接后转化入大肠杆菌，提质粒后分 KpnⅠ/EcoRⅠ和 PstⅠ/KpnⅠ酶切验证鉴定阳性克隆，验证正确后将重组质化入农杆菌保存，即获得用于VIGS 系统中沉默GaTOP6B的pTRV2-GaTOP 组 质 粒 和 用 于 构 建 超 表 达 GaTOP6B 转 基 因 拟 南 芥AMBIA1300-GaTOP6B 重组质粒。
图 2.1 GaTOP6B 的 cDNA 部分片段克隆（A）和 GaTOP6B 的 ORF 全长克隆（B）2.3.2 基于 VIGS 系统 pTRV2-GaTOP6B 和过表达 pCAMBIA1300-GaTOP6B的载体的构建将PCR扩增产物经电泳跑胶检测表明目的片段均已克隆出来（图2.2A和B）。将目的片段切胶回收后由上海生工生物公司测序后经比对确认扩增片段为构建载体所需要的片段。将目的片段与载体连接后转化入大肠杆菌，提质粒后分别用 KpnⅠ/EcoRⅠ和 PstⅠ/KpnⅠ酶切验证鉴定阳性克隆，验证正确后将重组质粒转化入农杆菌保存，即获得用于VIGS 系统中沉默GaTOP6B的pTRV2-GaTOP6B重 组 质 粒 和 用 于 构 建 超 表 达 GaTOP6B 转 基 因 拟 南 芥 的pCAMBIA1300-GaTOP6B 重组质粒。
本文编号：2764590
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S562
【图文】：
复制制又称为核内再复制，是多细胞真核生物的一种细胞周包括完整的基因组复制（S 期），但缺乏 M 期的染色体分 期特异性特征[1, 2]，细胞不断重复地复制其 DNA 而跳过胞质分裂，最终导致细胞的多倍化（图 1）[3]。核内复制控，从而有助于植物器官生长并促进植物产量[4]。细s）与细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）的复合物活性是转换[5]。为了结束有丝分裂进程并进入核内循环，一些 C必须下调，这个过程在真核生物中是非常保守的[2, 6]。会导致细胞基本特性的变化（如细胞增大和细胞得快速在植物体的生长发育和生理过程中有着重要的作用[8, 9]。数量的增加，特定细胞的代谢需求可以通过增加基因组如通过全基因组表达增加或者通过代谢途径中基因的差制在细胞分化或适应胁迫中同样发挥着重要的作用[10]。
图 2.1 GaTOP6B 的 cDNA 部分片段克隆（A）和 GaTOP6B 的 ORF 全长克隆（B）.3.2 基于 VIGS 系统 pTRV2-GaTOP6B 和过表达 pCAMBIA1300-GaTOP载体的构建将PCR扩增产物经电泳跑胶检测表明目的片段均已克隆出来（图2.2A和目的片段切胶回收后由上海生工生物公司测序后经比对确认扩增片段为构体所需要的片段。将目的片段与载体连接后转化入大肠杆菌，提质粒后分 KpnⅠ/EcoRⅠ和 PstⅠ/KpnⅠ酶切验证鉴定阳性克隆，验证正确后将重组质化入农杆菌保存，即获得用于VIGS 系统中沉默GaTOP6B的pTRV2-GaTOP 组 质 粒 和 用 于 构 建 超 表 达 GaTOP6B 转 基 因 拟 南 芥AMBIA1300-GaTOP6B 重组质粒。
图 2.1 GaTOP6B 的 cDNA 部分片段克隆（A）和 GaTOP6B 的 ORF 全长克隆（B）2.3.2 基于 VIGS 系统 pTRV2-GaTOP6B 和过表达 pCAMBIA1300-GaTOP6B的载体的构建将PCR扩增产物经电泳跑胶检测表明目的片段均已克隆出来（图2.2A和B）。将目的片段切胶回收后由上海生工生物公司测序后经比对确认扩增片段为构建载体所需要的片段。将目的片段与载体连接后转化入大肠杆菌，提质粒后分别用 KpnⅠ/EcoRⅠ和 PstⅠ/KpnⅠ酶切验证鉴定阳性克隆，验证正确后将重组质粒转化入农杆菌保存，即获得用于VIGS 系统中沉默GaTOP6B的pTRV2-GaTOP6B重 组 质 粒 和 用 于 构 建 超 表 达 GaTOP6B 转 基 因 拟 南 芥 的pCAMBIA1300-GaTOP6B 重组质粒。
【参考文献】
相关期刊论文 前4条
1 田又升;王志军;于航;董永梅;张国丽;马盼盼;谢宗铭;;干旱胁迫对不同抗旱性棉花品种抗氧化酶活性及基因表达的影响[J];西北植物学报;2015年12期
2 王娅玲;李维峰;;干旱胁迫对植物生长及其生理的影响概述[J];南方农业;2015年06期
3 王玉珏;付秋实;郑禾;温常龙;程琳;赵冰;郭仰东;;干旱胁迫对黄瓜幼苗生长、光合生理及气孔特征的影响[J];中国农业大学学报;2010年05期
4 张雪妍;刘传亮;王俊娟;李付广;叶武威;;PEG胁迫方法评价棉花幼苗耐旱性研究[J];棉花学报;2007年03期
本文编号：2764590
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