香菇耐高温相关邻氨基苯甲酸合酶基因功能分析

发布时间：2020-07-21 19:55

【摘要】：香菇(Lentinula edodes(Berk.)Pegler)是我国最重要的商业化栽培的食用菌之一。但栽培期间环境温度过高,会影响菌丝体生长发育,甚至导致菌棒腐烂,造成严重的经济损失。前人研究表明,邻氨基苯甲酸合酶(EC:4.1.3.27)(anthranilate synthase,TrpE)是生物体内一种重要的逆境诱导蛋白,对嗜热链球菌(Thermus thermophilus)在高温环境下的生存能力具有十分重要的作用。本实验室前期研究发现,香菇栽培菌株S606在40℃胁迫24h后,邻氨基苯甲酸合酶(LeTrpE)蛋白表达水平出现大幅度上调,但转录水平却明显下降,尤其在培养基中添加邻氨基苯甲酸能提高菌丝耐热能力,因此推测邻氨基苯甲酸合酶基因(LetrpE)在香菇热胁迫中可能发挥了重要作用(未发表数据)。本课题分别采用RNAi和超表达技术对邻氨基苯甲酸合酶基因在香菇中的功能进行了初步研究。本研究以香菇栽培菌株S606为试验材料,以表达潮霉素抗性基因的pCAMBIA1300-g为载体骨架。以LeTrpE功能结构保守区域395bp的反向互补片段为干扰片段,构建以Legpd和Leactin双向启动子的RNAi载体;以LetrpE基因cDNA为超表达的目的片段,构建以Leactin为启动子的超表达载体。采用根癌农杆菌介导转化法转化香菇菌株S606,在潮霉素培养基上经5次筛选获得稳定生长的转化子。将得到的转化子采用特异性引物进行扩增,获得11个RNAi转化子及20个超表达转化子。对RNAi转化子进行实时荧光定量PCR分析,发现LetrpE-i-37和LetrpE-i-53两个转化子LetrpE基因的表达量下调至野生型菌株的29.33%和42.78%,确认它们为LetrpE基因的RNAi转化子;上述两个RNAi转化子的菌丝体在40℃处理24h后,检测到吲哚-3-乙酸合成途径中LetrpB、LeTam-1和LeYUCCA基因表达量均出现了下调,且热处理后菌丝体25℃下不能恢复生长,但野生型S606菌株可以恢复生长。对超表达转化子实时荧光定量PCR分析,发现LetrpE-o-11,LetrpE-o-13和LetrpE-o-14等3个转化子的LetrpE基因表达量较野生型菌株上调2~3倍,确认它们为LetrpE基因的超表达转化子;qRT-PCR分析表明,3个超表达转化子吲哚-3-乙酸合成途径中基因LetrpB和LeTam-1基因的表达量均上调2倍以上,生长素合成基因LeYUCCA表达量上调10倍以上;3个超表达转化子菌丝体在41℃热处理24h后可以恢复生长,但野生型S606菌丝体在25℃时不能恢复生长。上述结果表明,香菇LetrpE基因位于吲哚-3-乙酸合成途径上游,且能够影响香菇菌株的耐热性。本研究对深刻揭示香菇耐热的分子机制和遗传基础,开展香菇耐热新品种选育,都具有十分重要的科学意义和实践价值。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S646.12
【图文】：

邻氨基苯甲酸,分支酸,步骤,β亚基

华中农业大学 2018 届硕士研究生学位（毕业）论文1.3.2 邻氨基苯甲酸合酶结构TrpE 由α亚基和β亚基组合的复合酶，等电点 5.1，分子质量为 143000 Da（Poulsen et al 1993）。TrpE 的α亚基是催化反应的关键亚基，能够独立地催化氨基与分支酸，生成邻氨基苯甲酸，其活性受色氨酸的反馈抑制；β亚基为α亚基的催化提供氨基，作用是催化谷氨酰胺转化为谷氨酸。TrpE 的α亚基和β亚基都参了谷氨酰胺依赖的邻氨基苯甲酸反应，大量的游离氨基存在时，α亚基也可以单独的催化合成邻氨基苯甲酸（图 1-1）（Romero et al 1995）。这 2 个反应且都需要 Mg2+作为辅因子（Niyogi & Fink 1992）。Kanno et al（2004）体外重构了水稻 TrpE 的同工酶，动力学分析发现，即使以 NH4+作为氨基供体时，α亚基也需要与β亚基结合才能获得最大酶活。

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3 结果与分析3.1 LeTrpE 蛋白结构和同源性分析以香菇单核体全基因组测序数据为基础，将 LetrpE 基因蛋白序列提交至 NCBIConserved Domian Search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi），分析 LeTrpE 蛋白的结构组成（图 3-1），发现 LeTrpE 蛋白包含 424 个氨基酸，属于 Chorismate_bind super family（54-409 AA），其中 54-133 为 LeTrpE 结构保守域。二级结构和三级结构预测结果显示，该蛋白以α-螺旋（11 个）和β-转角（17 个）为主；Interpro 蛋白功能预测 LeTrpE 分子量是 47.00kDa，等电点为 6.37，参与细胞内色氨酸代谢过程。在 NCBI 上通过 CDS 翻译的氨基酸序列对 LeTrpE 蛋白进行同源性比对分析，发现香菇 LeTrpE 和其它真菌的蛋白的同源性差异较大，说明是一种比较独特的蛋白（图 3-2）。

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于 Chorismate_bind super family（54-409 AA），其中 54-133 为 LeTrpE 结构保守域二级结构和三级结构预测结果显示，该蛋白以α-螺旋（11 个）和β-转角（17 个为主；Interpro 蛋白功能预测 LeTrpE 分子量是 47.00kDa，等电点为 6.37，参与细胞内色氨酸代谢过程。在 NCBI 上通过 CDS 翻译的氨基酸序列对 LeTrpE 蛋白进同源性比对分析，发现香菇 LeTrpE 和其它真菌的蛋白的同源性差异较大，说明一种比较独特的蛋白（图 3-2）。图 3-1 香菇 LeTrpE 蛋白功能结构域Fig 3-1 Functional motif of LeTrpE in L.edodes

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