牡丹DGAT基因和PEPC基因的克隆及表达分析

发布时间：2020-07-22 22:17

【摘要】：牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)是一种芍药科(Paeoniaceae)芍药属(Paeonia)的多年生落叶植物,广泛分布于山东、河南等地。牡丹籽油含多种不饱和脂肪酸而被卫生部批准成为新资源食品。近年来,分子生物技术被广泛应用到植物油脂合成的研究中,其中,与油脂合成有关的基因及其功能为研究热点。本研究以牡丹种子为材料,依据GenBank发布的二酰甘油酰基转移酶DGAT基因和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PEPC基因的保守片段分别设计简并引物,采用RT-PCR和RACE等方法,克隆得到牡丹DGAT基因和PEPC基因的全长序列,并进行生物信息学分析;采用qRT-PCR技术分析这两个基因在牡丹的不同器官、种子不同的发育过程及收获阶段中的表达特性。主要研究结果如下:1、牡丹DGAT基因的克隆及生物信息学分析采用RT-PCR和RACE方法从牡丹种子中克隆得到1个二酰甘油酰基转移酶DGAT基因,命名:PaDGAT1(GenBank登录号:MG214258)。PaDGAT1基因的cDNA全长为2028 bp,含有1554 bp开放阅读框,编码517个氨基酸。PaDGAT1蛋白属于疏水性碱性蛋白,分子量约是58.86 kD,理论等电点是8.62,二级结构预测显示,该蛋白以无规则卷曲和延伸链为主。氨基酸序列比对和进化树分析表明,PaDGAT1蛋白属于DGAT1亚家族,与油橄榄(Olea europaea)DGAT1蛋白亲缘关系最近。2、牡丹PEPC基因的克隆及生物信息学分析采用RT-PCR和RACE技术从牡丹种子中克隆得到1个磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PEPC基因,命名为PaPEPC(GenBank登录号:MH106701)。PaPEPC基因cDNA全长为3524 bp,含有2898 bp开放阅读框,编码965个氨基酸,PaPEPC蛋白为亲水性蛋白,分子量约为110.31 kD,理论等电点为5.85,二级结构预测表明,该蛋白以α螺旋为主。氨基酸序列比对和进化树分析表明,PaPEPC蛋白属于C_3型PEPC蛋白,与木本棉(Gossypium arboreum)PEPC蛋白亲缘关系最近。3、牡丹PaDGAT1基因的表达分析采用实时荧光定量PCR技术分析牡丹PaDGAT1基因,结果表明,该基因在花芽中高表达,在叶、茎和未发育子房中低表达;在种子发育过程中,表达水平呈现出升高-降低-升高的趋势,其中在发育28 d时表达水平最高,随后表达水平降低,发育70 d时又升高,至发育末期的85 d时表达水平升至较高水平;种子收获后,常温存放7 d时,表达水平最高,随后逐渐下降。4、牡丹PaPEPC基因的表达分析采用实时荧光定量PCR技术分析牡丹PaPEPC基因,结果表明,该基因在花芽中高表达,在叶中低表达;在种子的发育前期表达水平不断升高,当子房发育至28 d时,表达水平最高,随后表达水平下降;种子收获后,其表达水平呈现出先升高后降低的趋势,常温存放7 d时表达水平最高。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2;S685.11
【图文】：

植物油脂,油体,油体蛋白,三酰甘油

1 引言用甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPAT）和溶血性磷脂酸酰基转移酶（LPAAT）进行催化转移，使其到 3-磷酸甘油的 sn-1 和 sn-2 位点并发生酯化作用生成磷脂酸，然后磷脂酸磷酸酶（PAP）将其水解成二酰甘油酯（DAG），最后在 DAG 的 sn-3位置上通过 DGAT 酶发生酰基化生成三酰甘油[35]。第三阶段是三酰甘油与油体蛋白结合成油体，油体蛋白在种子干燥过程中能使油体维持稳定的状态，与改变油体膜的结构有关[36]。随着脂肪酸代谢研究的深入，我们发现了许多与油脂代谢相关的基因和调控油脂代谢生化途径中的关键酶。

果实形态,牡丹花

2 材料与方法2 材料与方法2.1 试验材料2.1.1 植物材料牡丹品种‘凤丹’为试验材料，由郑州师范学院生物工程研究所提供。取牡丹花蕾期的叶片、花芽、未发育子房及嫩茎各组织；从 2017 年 4 月底牡丹花败后开始采摘直到 7 月底，选取生长状态一致的牡丹植株，每两周取其种子，并测量其聚合勄刅果的相关形态特征（图 2.1）；7 月底将种子采收并常温自然保存后，以采收当天的种子作为 CK 对照，每 7 d 取 1 次，共取 4 次。每次取 3 株上的样品作为 3 个生物学重复，液氮冷冻后保存在-80 ℃超低温冰箱。0 2 cm 0 2 cm0 2 cm0 2 cm

电泳图,牡丹,电泳图,简并引物

3.1 牡丹总 RNA 电泳图隆的克隆板，分别利用简并引物AT 基因的特异性保守片 3.2）。通过 Blast 工具进具有较高的一致性，通因的保守片段，且能够M 1

【参考文献】