莲藕PIP家族基因的克

发布时间：2020-07-22 21:49

【摘要】：莲藕(Nelumbo nucifera Gaertn.)是睡莲科莲属多年生水生草本植物,原产于中国和印度,现于东南亚、日本及中国均有栽培。莲藕是我国种植面积最大的水生蔬菜,其产品包括鲜藕、莲籽和藕粉,含有丰富的蛋白质、淀粉、矿质营养及多种维生素,具有较好的保健功能,深受大众消费者的喜爱。目前莲藕栽培种对盐敏感,而耐盐品种存在于野生资源中。随着我国土壤盐渍化范围及沿海滩涂面积不断扩大,培育莲藕耐盐新品种,使其在含盐量较高的盐渍化土壤中栽培,既有利于提高土地利用率,同时又改善了当地环境。质膜内在蛋白(PlasmaMembrane InstrinsicProtein,PIP)是目前研究较多的水通道蛋白中的一种,研究表明PIP具有提高植物耐盐性的作用[1]。由于受细胞膜的限制,PIP可能通过介导叶和根中水分的跨细胞运输来提高植物的耐盐能力。因此,本研究从耐盐野生莲中克隆了PIP家族基因,并研究了其在逆境胁迫下的表达特征,同时对盐诱导的基因(NnPIP1-2、NnPIP2-1和NnPIP2-7)进行了过表达载体的构建,结果如下:1、采用RT-PCR技术,从野生耐盐莲藕资源H5中克隆得到8个PIP家族基因,基因核苷酸全长在843 bp-864 bp之间。通过对比NCBI数据库,我们发现本实验得到的莲藕PIP家族基因和拟南芥、水稻和玉米PIP家族基因的同源性较高,家族基因之间的同源性在67%-90%,因此把本实验克隆的基因命名为NnPIPs。进一步研究表明NnPIP1与AtPIP1和NnPIP2与AtPIP2之间的同源性要高于NnPIP1与NnPIP2之间的同源性,表明NnPIP1和NnPIP2属于同一基因家族中的2个亚类。在基因结构上,NnPIPs中每个成员都具有6个α-跨膜螺旋和5个相连接的环(A环-E环),且B环和E环上均有一个NPA(Asn-Pro-Ala)结构域,这是植物体运输水和CO2等一些小分子的基本结构。2、利用半定量RT-PCR及qRT-PCR技术,以β-actin为内参,分别在NaCl、甘露醇、ABA、低温和PEG处理0 h、6 h、12 h、18 h、24 h研究了NnPIPs在莲藕H5中的表达特性。结果表明:在250 mMNaCl处理下,NnPIP1-2的表达量在0-24 h呈上调趋势,处理24 h达到最高,NnPIP2-和NnPIP2-7的表达量在0-12 h呈上调趋势,12 h后达到最高,NnPIP1-3和NnPIP1-4的表达量在NaCl处理后下降,NnPIP1-1和NnPIP2-8在处理的时间内不受盐诱导,表达量无显著改变;在200mM甘露醇处理下,NnPIP1-1、NnPIP1-2、NnPIP1-3、NnPIP1-4、NnPIP2-1和NnPIP2-7的表达量均无显著改变,NnPIP2-8的表达量在处理12h后显著增加,18h表达量达到最大值;在50μMABA处理下,NnPIP1-3、NnPIP2-1、NnPIP2-7和NnIP2-8的表达量在ABA处理后6 h至18 h期间呈不同程度的增加,NnPIP1-1、NnPIP1-2和NnPIP1-4的表达量在处理时间内无显著变化;在低温(4℃)处理下,NnPIP1-1和NnPIP2-7的表达量在低温处理后18 h达到最大,NnPIP1-2、NnPIP1-3和NnPIP2-8的表达量在处理24 h内无显著变化,NnPIP1-4和NnPIP2-1的表达量在0-24 h内呈下降趋势;利用10%PEG6000处理莲藕幼苗24h,发现NnPIP1-1、NnPIP1-2、NnPIP1-3、NnPIP2-1、NnPIP2-7和NnPIP2-8 的表达量在 24 h 内显著增加,而NnPIP1-4的表达量先下降,然后上升。以上数据表明,NnPIPs在响应不同逆境胁迫时,其表达模式具有多样性特征。3、本实验利用pAMBIA 1301过表达载体对上述3个盐诱导的PIP家族基因(NnPIP1-2、NnPIP2-1、NnPIP2-7)进行了载体构建,以便进一步研究基因功能。通过双酶切和PCR鉴定,我们认为成功地构建了pAMBIA1301-NnPIP1-2、pAMBIA1301-NnPIP2-1和pAMBIA1301-NnPIP2-7 过表达载体。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S645.1
【图文】：

信号传导通路,活性氧

基因的研究进展逡逑盐基因的研究较为深入，这些基因主要有氧胁迫相码转录因子的调节基因、离子转运相关基因、解旋因逡逑会产生大量的活性氧，这些活性氧能够破坏生物膜，统。当植物导入解毒酶或调控氧化胁迫相关酶基因后定膜结构和蛋白复合体，细胞耐脱水能力得到提高。）调控不同的防御反应和发育途径，高盐、重金属和达，进而提高了植物对逆境胁迫环境的适应能力Ｐ］。

莲藕,全长克隆,数位,拟南芥

逡逑管逡逑图２．１莲藕总ＲＮＡ的凝胶电泳图逡逑Ｍ：分子量标记；１－４：样品ＲＮＡ逡逑Ｆｉｇ．２．１邋Ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ邋ｅｘｔｒａｃｔｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ｉｍｍａｔｕｒｅ邋ｌｅａｖｅｓ邋ｏｆ邋ｌｏｔｕｓ邋ｒｏｏｔ逡逑Ｍ：邋ＤＬ邋５０００邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１－４：邋ＲＮＡ邋ｅｘｔｒａｃｔｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ｌｏｔｕｓ邋ｒｏｏｔ逡逑２．２逦ｃＤＮＡ序列的克隆及分析逡逑２．２．１逦ｃＤＮＡ序列的克隆逡逑对莲藕进行ｃＤＮＡ全长克隆，利用１邋％琼脂糖凝胶电泳对ＰＣＲ反应产物进行检逡逑测。结果如图２．２所示：ＰＣＲ产物的大小均在８６０ｂｐ左右，与预期大小一致。测序后，发逡逑现目前我们克隆到的ＰＩＰｓ基因的核苷酸数位于８４３￣８６４ｂｐ，编码氨基酸残基数在２８０？２８７逡逑（表２．２所示）。Ｂｌａｓｔ比对后发现，８个ｉＶ／ｉＰ／作与ＮＣＢＩ数据库中拟南芥、玉米和水稻种逡逑的Ｐ／Ａ相似度较高，因此命名为逡逑１０００ｂｐ－＾Ｐ逦＾邋ＭＶ＇逦＾邋ｆ逡逑７５０邋ｂｐ＋＿＿｜＿｜＿＾｜＿｜＿｜｜＿＿灥媝＿｜逡逑图２．２逦ＰＣＲ扩增结果检测图逡逑Ｍ．／六予ｉ标记＇逦ＮｎＰＩＰｌ－１，ＮｎＰＩＰｌ－２，邋ＮｎＰＩＰｌ－３，邋ＮｎＰＩＰｌ－４，邋ＮｎＰＩＰ２－ｌ，ＮｎＰＩＰ２－４，邋ＮｒｉＰＩＰ２－７，逡逑ＮｎＰＩＰ２－８逡逑Ｆｉｇ．２．２邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ＮｎＰＩＰｓ逡逑Ｍ：邋ＤＬ邋２０００邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１－８：邋ＮｎＰＩＰｌ－ｌ邋ＮｎＰＩＰｌ－２

莲藕,凝胶电泳,分子量,样品

逦ｃＤＮＡ序列的克隆逡逑对莲藕进行ｃＤＮＡ全长克隆，利用１邋％琼脂糖凝胶电泳对ＰＣＲ反应产物进行检逡逑测。结果如图２．２所示：ＰＣＲ产物的大小均在８６０ｂｐ左右，与预期大小一致。测序后，发逡逑现目前我们克隆到的ＰＩＰｓ基因的核苷酸数位于８４３￣８６４ｂｐ，编码氨基酸残基数在２８０？２８７逡逑（表２．２所示）。Ｂｌａｓｔ比对后发现，８个ｉＶ／ｉＰ／作与ＮＣＢＩ数据库中拟南芥、玉米和水稻种逡逑的Ｐ／Ａ相似度较高，因此命名为逡逑１０００ｂｐ－＾Ｐ逦＾邋ＭＶ＇逦＾邋ｆ逡逑７５０邋ｂｐ＋＿＿｜＿｜＿＾｜＿｜＿｜｜＿＿灥媝＿｜逡逑图２．２逦ＰＣＲ扩增结果检测图逡逑Ｍ．／六予ｉ标记＇逦ＮｎＰＩＰｌ－１，ＮｎＰＩＰｌ－２，邋ＮｎＰＩＰｌ－３，邋ＮｎＰＩＰｌ－４，邋ＮｎＰＩＰ２－ｌ，ＮｎＰＩＰ２－４，邋ＮｒｉＰＩＰ２－７，逡逑ＮｎＰＩＰ２－８逡逑Ｆｉｇ．２．２邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ＮｎＰＩＰｓ逡逑Ｍ：邋ＤＬ邋２０００邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１－８：邋ＮｎＰＩＰｌ－ｌ邋ＮｎＰＩＰｌ－２，邋ＮｎＰＩＰｌ－３，邋ＮｎＰＩＰｌ－４ｙ邋ＮｎＰＩＰ２－ｌ，邋ＮｎＰＩ

【参考文献】