丹酚酸B生物合成关键基因在丹参叶片分化不定芽中的表达

发布时间：2020-07-24 20:37

【摘要】：本文以丹参无菌苗叶片为外植体,采用组织培养技术研究了植物生长调节剂6-BA和NAA对丹参叶片的诱导分化,建立了丹参的高效再生体系,以此为基础,利用分子生物学技术研究了丹参叶片分化过程中丹酚酸生物合成途径关键酶基因表达和不定芽分化关系。建立了丹参叶片农杆菌介导的遗传转化体系。本研究为揭示丹参器官分化与丹酚酸生物合成之间的关系及利用超表达和抑制表达研究丹酚酸生物合成相关基因功能奠定基础。主要研究结果包括:1.丹参高效再生体系的建立:以丹参无菌苗叶片为外植体,接种于附加植物生长调节剂6-BA,NAA的MS基本培养基中,发现单独使用6-BA或NAA几乎无愈伤组织和丛生芽的分化,组合使用两种外源激素能获得分化状态好的愈伤组织,愈伤组织诱导率为100%,不定芽分化率为14%-87%;过高浓度的6-BA会抑制愈伤组织的诱导,高浓度的NAA会使愈伤组织褐化,最佳的激素配比为:MS+6-BA3.0mg·L~(-1)+NAA0.2mg·L~(-1),愈伤组织诱导率可达到100%,不定芽的分化率可达到80%;1/2MS+NAA0.1mg·L~(-1)为最佳生根培养基,根诱导率为100%。2.研究了不同分化状态的丹参组织中生理生化指标变化。测定了叶片、分化愈伤组织和难分化愈伤组织中脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖含量和苯丙氨酸解氨酶活性等,发现在难分化愈伤组织中脯氨酸和可溶性糖含量最高,叶片最低;苯丙氨酸解氨酶活性难分化愈伤组织最高;叶片中可溶性蛋白含量最高。3.分析了不同分化状态的丹参组织与丹酚酸生物合成途径关键酶基因表达量之间的关系。测定了丹参分化芽的愈伤组织和难分化愈伤组织中不同阶段丹酚酸生物合成关键酶基因的相对表达量,发现Sm4cl、Smhppr在分化芽和未分化愈伤组织中呈现先下降后上升的趋势;Smc4h呈现不断下降的趋势;在培养23 d时,分化芽愈伤组织Smhppr表达量比难分化愈伤组织高13%,在7、15和23 d时,Sm4cl分别高75%、32%和86%;Smc4h分别高61%、47%和40%。结合前期试验结果发现在难以分化愈伤组织分化生长过程中丹酚酸的积累量少,而在分化芽愈伤组织中丹酚酸积累量升高,说明丹酚酸含量与3个基因的表达密切相关。3个基因在根、茎、叶的表达量均高于花序。Smc4h分别高85%、81%和80%;Sm4cl分别高87%、84%和82%;Smhppr分别高74%、79%和18%。4.以gfp基因作为外源标记基因,建立了农杆菌介导的丹参叶片遗传转化体系,转化率最高可达40%。
【学位授予单位】：河北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S567.53
【图文】：

生根率,丹参,不定芽,株高

表 2 不同浓度 NAA 对丹参不定芽生根的影响Tab.2 Effects of different concentrations of NAAon rooting of Salvia miltiorrhiza激素浓度/mg·L-1Hormone concentration生根时间/dThe time ofroot/d根诱导率/%Rootinductionrate/%株高/cmPlant height/cm根长/cmRoot length/cm生长势The growthpotential1/2MS 23 38±7.46c 7.80±0.73a 4.93±1.01ab ＋1/2MS+0.1 NAA 6 100±0.00ab 8.90±1.78a 6.75±0.72a ＋＋＋1/2MS+0.5NAA 9 100±0.00ab 10.10±1.87a 3.93±0.37bc ＋＋＋1/2MS+1.0 NAA 15 88.9±13.2b 8.72±1.87a 2.38±0.19c ＋＋：+：一般 ++：较好 +++：很好ote:+:common ++:better +++:good而在其根诱导率方面不含激素的培养基中生根率只有 38%，表现为显著性差异（P<0.05），当 NAA 浓度 0.1-0.5 mg·L-1时，生根率为 100%，在 NAA 浓度为 0.1-1.0mg·L-的范围内差异不显著(P>0.05)。

再生芽,茎段,浓度

河北大学理学硕士学位论文表 3 不同浓度 6-BA 对丹参带叶腋茎段分化出芽的影响3 The effects of 6-BAconcentration on the differentiation of bud in axillary stem of Salvia miltio养基mediumρ(6-苄基氨基嘌呤)/(mg·L-1)6-Benzylaminopurine出芽时间/dBudding time/d再生芽诱导率/%Regeneration budinduction rate/%再生芽生RegenerationstaS 0.5 4 100 ＋S 1.0 3 100 ＋＋S 1.5 3 100 ＋+：较好 +++：很好 ++:better +++:good丁酸对茎段分化丛生芽有明显的促进作用；通过比较 6-BA 0.5m 1.5 mg·L-1浓度下培养 10 d 的丛生芽生长状态（图 4）发现，浓度为

移栽苗,丹参

第 2 章丹参高效组织培养体系的建立2.5.1.6 再生植株的驯化与移栽将在罐头瓶中培养 30 d 的根系发达茎秆粗壮的丹参植株开口放于植物培养室中适应 2-3 d，后洗去植株根部的培养基栽种于营养土:砂土:黏土:蛭石=1:1:1:1 的灭菌基质中，给与稳定的培养条件使之生长。

【参考文献】