黄瓜耐铜相关基因CsLecRK克隆及功能分析

发布时间：2020-07-25 17:09

【摘要】：黄瓜(Cucumis sativus L.)属葫芦科甜瓜属蔬菜,是全球消费量最大的十类蔬菜之一,深得世界各国人民喜爱。也是一种对铜(Cu)胁迫非常敏感的蔬菜作物。近年来,随着高Cu畜肥、杀菌剂、杀虫剂等的不合理施用,使土壤Cu污染日益严重,进而对蔬菜的产量和品质造成较大影响,或间接通过食物链途径来危害动物和人类。因此有效提高黄瓜耐Cu胁迫能力,培育耐Cu黄瓜品种对于创造绿色农业、现代农业具有重要意义。为了探究黄瓜耐Cu分子机制,挖掘耐Cu相关基因能够为耐Cu黄瓜品种提供理论参考。为了加深人们对黄瓜耐Cu机制的理解,本研究以黄瓜品种‘649’为试验材料。根据目标基因CsLecRK响应Cu的表达模式及保守性为线索,结合转基因等技术,克隆黄瓜耐Cu相关基因CsLecRK,同时对CsLecRK基因功能进行分析,初步阐述黄瓜耐Cu相关基因CsLecRK在Cu胁迫过程中的生理与分子作用机制。主要研究结果如下:(1)前期基于拟南芥在Cu胁迫下基因的表达模式分析,进而将其基因序列与黄瓜基因组数据库进行同源比对,又结合采用生物信息学分析方法对黄瓜中潜在的耐Cu相关基因进一步筛选,并保证该基因在相关重金属的功能尚未见报道,初步将拟南芥LecRK基因设定为研究的对象。通过DNAMAN软件对该基因和CsLecRK的氨基酸同源性进行比较,得出二者同源性为46%。进一步通过qRT-PCR分析表明,CsLecRK在Cu胁迫条件下表达显著下调,降低了4.39倍。本研究结果表明CsLecRK在黄瓜中受Cu胁迫诱导特异表达,该基因可能与黄瓜耐Cu能力相关。也暗示CsLecRK为黄瓜耐Cu胁迫的新基因。(2)采用PCR技术克隆黄瓜耐Cu胁迫相关基因CsLecRK,其CDS全长为2121 bp,编码一个含有706个氨基酸的蛋白质,属于LecRK超家族之一,理论分子量为78.36 kDa,等电点为7.76。NCBI Blastp分析与进化树分析均表明,CsLecRK编码蛋白与甜瓜的LecRK序列同源性最高(95%),进化距离最近。(3)构建植物过量表达载体1250-3301::CsLecRK,将CsLecRK基因转入哥伦比亚野生型拟南芥。结果表明,50?M Cu处理后野生型根长明显受到抑制而变短,为0.8443±0.0628 cm;在正常条件下,转基因植株与野生型根长没有显著差异,在50?M Cu胁迫条件下野生型和转基因植株根长都明显变短,但转基因的根长仍然比野生型长。此外,在50?M Cu胁迫条件下,野生型和3个转基因植株地上部及根部的鲜重和干重分别减少,较正常条件下,地上部鲜重分别减少了59.16%、33.92%、29.36%、43.65%,根部鲜重分别减少了68.46%、51.39%、51.42%、49.49%。地上部干重分别减少了66.19%、40.72%、32.06%、24.47%。(4)将转基因拟南芥株系和野生型拟南芥进行正常条件和50?M Cu处理,过氧化氢(H_2O_2)和丙二醛(MDA)测定结果表明:转基因植株地上部H_2O_2含量在正常条件下显著高于野生型植株H_2O_2含量,然而在50?M Cu胁迫下,二者H_2O_2含量没有显著差异,但在根部组织中,50?M Cu胁迫下,转基因植株的H_2O_2含量显著低于野生型,此外,在正常条件下,地上部转基因植株与野生型的MDA含量无明显差异,但50?M Cu胁迫下,无论是地上部还是根组织中转基因植株的MDA含量显著低于野生型。而Cu胁迫后转基因株系的地上部或根中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性水平明显高于野生型。又通过萌发率结果发现:在0.3μM ABA的MS培养基上,3个转基因拟南芥种子萌发率显著高于野生型,这些结果表明在Cu胁迫以后,CsLecRK基因过表达可能参与ABA信号的转导,降低植株内H_2O_2和MDA的含量的累积,进一步提高植物体内抗氧化酶活性水平,从而在Cu胁迫条件下能够提高植株的Cu耐受性来维持其正常生长发育。此外,Cu处理后转基因株系中Cu调节基因AtSPL7,ABA响应基因AtRAB18和AtABI5表达量明显高于野生型。这说明转基因植物表现出的Cu耐受性可能由于这些基因编码的蛋白质之间的相互协作。上述结果表明CsLecRK的过量表达可以提高拟南芥的Cu耐受性。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S642.2
【图文】：

基因图,氨基酸序列分析,基因

lus；1：CsLecRK 基因图 3-3 CsLecRK 全长扩增Fig.3-3 Cloning of CDS sequences of CsLecRK 基因氨基酸序列分析及进化

超基因家族,氨基酸序列,序列,蛋白

图 3-4 CsLecRK 序列与氨基酸序列信息Fig.3-4 Information of CsLecRK and amino acid sequence in Cucumber用 NCBI对该基因的氨基酸序列保守结构域分析发现（图 3-5），其蛋白属于 lectinfamily 和 PKc-like superfamily 超基因家族之一。

CsLecRK蛋白保守结构域Fig.3-5ConserveddomaininCsLecRK

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