【摘要】：14-3-3蛋白是植物细胞内蛋白质间相互作用的核心,14-3-3蛋白通过与靶蛋白结合从而调节各种生命活动,广泛参与植物体内物质运输、生长发育、营养代谢、细胞周期、胁迫应答及光信号传导途径等生理过程的调控。生物和非生物胁迫刺激不仅改变植物中编码14-3-3蛋白基因的转录和蛋白表达水平,同时还改变14-3-3蛋白与靶蛋白的相互作用。很多研究证实14-3-3蛋白可通过调控抗氧化酶基因的表达来影响其活性。此外,14-3-3蛋白还通过与代谢酶的互作对碳和氮代谢进行调控。植物体内14-3-3蛋白由多基因编码,不同14-3-3基因在功能上有其特异性。因此,要考察植物体内不同14-3-3基因的功能时不仅要分析14-3-3基因的表达水平,还需要考察14-3-3蛋白调控靶蛋白表达水平的变化。目前在科研和诊断中检测基因转录水平多采用RT-PCR,检测蛋白表达水平多采用Western Blot,但这些方法都存在着各自的不足,荧光定量PCR仪在使用过程中运行成本较高,无论是仪器还是耗材的成本都不低;Western Blot分析方法在操作时往往存在操作繁琐、检测限低等不足。电化学分析方法具有选择性好、样品不需预处理、可实现连续在线监测、测定成本远低于大型分析仪器等优点。本论文构建高灵敏性的电化学DNA传感器和电化学免疫传感器,对本实验室之前获得的转基因烟草中14-3-3c和14-3-3g及其调控靶蛋白基因的转录和蛋白表达水平进行分析,考察14-3-3c和14-3-3g在烟草应答甲醛胁迫中的作用,主要研究结果如下:1、基于碱基互补配对原理利用丝网印刷电极构建DNA传感器,通过壳聚糖把碳纳米管和单链DNA探针固定在工作电极表面,在适宜的条件下与溶液中的互补序列进行杂交形成双链DNA,然后利用电化学方法检测杂交前后的电化学信号的变化,检测不同浓度的目标序列。结果说明目标序列浓度在0.5-1μmol/L范围内时,DPV曲线的峰电流值与目标序列浓度呈良好的线性关系,线性回归方程为y=-8.225x+34.84(R2=0.836)。从转基因烟草叶片中提取总RNA,与电极片上的单链DNA探针进行杂交反应,检测14-3-3c和g基因的转录水平,结果说明与WT相比,14-3-3c(ic4)和14-3-3g(ig2)的RNAi干扰表达植株中这两个基因的转录水平分别下降62.5%和67.4%;14-3-3c(kc1)和14-3-3g(kg2)的过量表达植株中14-3-3c和g基因的转录水平分别上升46.5%和36.8%。这个结果与RT-PCR分析结果相一致,使用该方法进行检测时,无需将所提的RNA反转成cDNA,相比RT-PCR节约了时间和成本。2、基于抗原和抗体间的高度特异性结合的原理,利用丝网印刷电极构建14-3-3蛋白的电化学免疫传感器,实现14-3-3蛋白的定量检测。在64 ng/m L到2000ng/ml浓度区间,IT曲线的电流峰值与14-3-3蛋白浓度呈现良好的线性关系,线性回归方程为:y=1.0113x+582.34(R2=0.9986),而Western Blot分析检测限只能达到μg/ml级别。利用14-3-3蛋白的电化学免疫传感器对转基因烟草中14-3-3蛋白表达水平进行定量检测,结果说明与WT相比,在ic4和ig2植株中14-3-3c和g蛋白的表达量分别下降54.7%和23.7%;在kc1和kg2植株中14-3-3c和g蛋白的表达量分别上升27.7%和27.8%。检测结果与传统的Western Blot方法检测结果相一致,但该方法灵敏度高、成本低且耗时少。3、利用电化学DNA传感器对14-3-3转基因烟草叶片抗氧化酶和甲醛代谢相关酶基因的转录水平进行定量分析,结果说明与WT相比,在14-3-3c和g的干扰表达植株中,APX转录水平分别上升28.4%和24.8%;CAT转录水平分别上升30.1%和25.7%;MnSOD转录水平分别上升17.7%和12.9%;Cu/ZnSOD转录水平分别上升7.4%和4.6%;POD转录水平分别上升12.9%和8.6%。14-3-3c和g的干扰表达植株中APX转录水平分别下降48.6%和15.9%;CAT转录水平分别下降85.5%和25.9%;MnSOD转录水平分别下降81.6%和51.8%;Cu/ZnSOD转录水平分别下降93.8%和23.2%;POD转录水平分别下降73.9%和64.2%。苹果酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶的转录水平与野生型相比,没有显著性差异,表明14-3-3c和g基因调控烟草甲醛代谢途径可能不通过转录水平实现。通过~(13)C-NMR分析结果证实在甲醛胁迫下14-3-3c的上调表达使转基因烟草叶片甲醛代谢产生更多的糖类物质和氮转运氨基酸,而干扰该基因的表达则抑制糖类物质和氮转运氨基酸的合成;干扰14-3-3g的表达抑制甲醛代谢产生糖类物质,但促进氮转运氨基酸的合成。
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2
【图文】：
4-3-3蛋白结构示意图
图 1.2 植物 14-3-3 蛋白的功能Fig. 1.2 functions of 14-3-3 proteins in plants1.6.2 14-3-3 蛋白调控靶蛋白的作用机制一般来说，14-3-3 蛋白通过同源二聚体或异源二聚体识别特定的磷酸化丝氨
图 1.3 14-3-3 蛋白对植物碳代谢和氮代谢的调控.3 14-3-3 regulation of carbon and nitrogen metabolism i4-3-3 蛋白对植物碳代谢的调控作用
【参考文献】
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本文编号：
2770018
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