棉花体细胞胚胎发生相关基因GhL1L1的克隆和功能验证

发布时间：2020-07-25 14:56

【摘要】：体细胞胚胎发生是植物体细胞不经过双受精在体外培养再生成为胚并发育成为一棵完整植株的过程。随着棉花组织培养及转基因技术的发展,棉花体细胞胚胎发生成为棉花遗传转化技术的基础。生长素是体细胞胚胎发生重要的调节因子之一。在本实验室前期的体胚发生表达谱中发现一个差异表达的NF-YB类转录因子,GhL1L1,该基因在棉花体细胞胚胎发生过程中差异表达。本研究对GhL1L1在棉花体细胞胚胎发生中的功能进行研究,结果如下:1、陆地棉GhL1L1的克隆及表达分析根据棉花体细胞胚胎发生过程的表达谱分析结果,我们克隆到陆地棉GhL1L1基因,编码NF-YB亚家族的蛋白;陆地棉TM-1全基因组存在41个NF-YB亚家族的基因,根据同源性比对结果,有6个属于LEC1类,其余为非LEC1类;6个LEC1类的NF-YB基因分别分布在A和D亚基因组上,编码3个同源的蛋白。组织表达模式分析发现LEC1类的NF-YB基因主要在开花后20天的种子、胚性愈伤组织、体细胞胚和合子胚等胚性细胞组织中表达,其中,GhL1L1(Gh_D05G1686)在胚性细胞组织中的表达量最高。2、陆地棉GhL1L1调控棉花体细胞胚胎发生过程中的细胞命运为了验证GhL1L1在棉花体细胞胚胎发生过程中的功能,我们构建了超表达和干涉表达载体并转化棉花。结果发现超表达GhL1L1抑制非胚性愈伤组织的起始和增殖,外植体的极性生长状态不明显,超表达GhL1L1促进胚性愈伤组织的产生及体细胞胚的发生,伴随着胚性细胞形成的标志基因Gh FUS3和Gh ABI3的表达量显著升高。GhL1L1干涉株系愈伤组织增殖率与对照相比差异不大,外植体愈伤组织的生长出现明显的极性生长,但GhL1L1干涉株系胚性愈伤产生的时间明显推迟。3、陆地棉GhL1L1影响棉花体细胞胚胎发生过程中生长素的积累和分布为了研究GhL1L1与生长素之间的关系,我们检测了GhL1L1转基因和对照株系诱导培养25 d、40 d的外植体和胚性愈伤组织中的生长素含量,结果显示超表达GhL1L1诱导25 d和40 d的外植体中的生长素含量显著高于对照和干涉株系;此外,在GhL1L1超表达株系胚性愈伤组织生长素的含量显著高于阴性对照,而GhL1L1干涉株系胚性愈伤组织生长素的含量显著低于阴性对照。为了研究GhL1L1与生长素分布的关系,GhL1L1转基因和阴性对照株系与DR5::GUS株系进行杂交,在超表达GhL1L1的茎顶端分生组织中GUS染色较深,有较多的生长素积累;通过GUS染色切片和IAA免疫荧光切片观察发现,在超表达和抑制表达GhL1L1的鱼雷胚中生长素的分布均会受到不同程度的影响。4、陆地棉GhL1L1与GhPP2AA2结合调控Gh PIN1蛋白的表达酵母单杂交和双荧光素酶报告基因检测系统实验验证,GhL1L1可以与GhPP2AA2启动子区域的G-box元件结合,调控其表达。此外,通过体外pull-down实验和体内Bi FC及蛋白共定位实验证明,GhPP2AA2可以与Gh PIN1蛋白相互作用,GhPP2AA2蛋白与拟南芥At PP2AA2蛋白较为同源,At PP2AA2可以去磷酸化PIN1蛋白,影响PIN1蛋白的磷酸化状态和定位。因此,GhL1L1可能通过GhPP2AA2调控Gh PIN1蛋白的活性而影响生长素的极性运输和分布。5、抑制生长素的极性运输可以促进棉花体细胞胚胎发生为了确定Gh PIN1蛋白的定位改变是否会影响棉花的体细胞胚胎发生,在GhL1L1转基因和阴性对照外植体诱导培养基中添加生长素运输抑制剂TIBA。结果发现,TIBA可以影响生长素的分布,抑制愈伤组织的增殖,诱导培养15 d GhL1L1转基因和阴性对照外植体的愈伤增殖没有明显的差异;同时,TIBA处理可以促进胚性愈伤组织细胞的提前分化,特别是在GhL1L1的干涉株系至少提前10天出现胚性愈伤组织,GhL1L1转基因和阴性对照株系外植体愈伤组织的分化率都有一定的提高。6、陆地棉GhL1L1调控脂肪酸的合成在棉花体细胞胚胎发生过程中超表达GhL1L1可以增加棉花亚油酸的含量。为了进一步研究GhL1L1的调控机理,我们通过酵母双杂交和免疫沉淀质谱分析(IP-MS)的方法鉴定GhL1L1相互结合的蛋白,通过Pull-down,Bi FC和Co-IP实验验证GhL1L1与Gh NF-YC2和Gh NF-YC9相互作用,GhL1L1与Gh NF-YC2可以与Gh SSI2的启动子结合,推测GhL1L1通过调控Gh SSI2影响脂肪酸的合成。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S562
【图文】：

模型图,拟南芥,胚胎发育,模型

植物的胚胎发生是植物生命周期中的一个重要过程。在高等植物中，植物的胚胎发生受到遗传和环境的共同影响，合子胚的发育过程经历了受精卵的分裂、极性的建立、形态建成和器官发生等一系列发育过程。模式植物拟南芥的胚胎发生过程研究的较为透彻，如图 1.1 所示，受精卵在自身的扩增后，经过一次极性的分裂形成顶细胞和基细胞，经过生长发育，顶细胞中的细胞质比较稠密，有大量有活性的蛋白质合成，发育成为原胚，而基细胞细胞质较少，随后发育高度液泡化，发育成胚柄（Mansfield et al., 1991）。顶细胞在经过两次垂直分裂和一次水平分裂后变成 8细胞胚，形成不同的细胞，行使不同的功能。随后进行快速分裂进入 16 细胞胚和早期心形胚时期，在胚发育的后期形成子叶胚。最上端的胚柄细胞发育成为胚根原细胞，根原细胞经过一次不对称分裂后变成上下两个细胞，上面的细胞经垂周分裂成两个细胞，形成拟南芥的静止中心，下面的细胞继续分裂形成小柱细胞，共同参与根尖分生组织的形态建成（Arnaud Capron et al., 2009; Scheres et al., 1994）。

示意图,极性运输,胞吞作用,磷酸化

图 1.2 PIN 蛋白依赖于磷酸化和胞吞作用的极性运输改变示意图；P，磷酸化蛋白；PID，PINOID；RE，再循环内体；TGN，高尔基体网络（atic representation of transcytosis and phosphorylation-dependent polarity EE, early endosomes; P, phosphorylated protein; PID, PINOID; REN, trans-golgi network (Grunewald et al., 2010).的胚胎发育，植物再生也是植物进行自我繁殖的一种有效手器官从头发生和体细胞胚胎发生。器官从头发生是植物实现拟南芥叶片离体培养可以自发再生出不定根，叶片离体后积素，促进叶片中细胞命运的转变从而实现根的从头再生过程物器官具有较强的再生能力，在绿藻，苔藓中存在很明显的根、茎、叶各个组织在一定的环境下培养可以进行器官再生

杭菊,再生细胞,植物,紫椴

而在不同的植物中，不同组织部位的外植体在一定的条件下也可进行体细胞再生（Ikeuchi et al., 2016），如图1.3 所示。同时，35S 启动子组成型超量表达转录因子 Baby Boom (BBM)、Wuschel2

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