水稻粒宽和粒重调控基因GW5L的克隆与功能分析

发布时间：2020-07-26 09:28

【摘要】：水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一,养活全球近60%的人口。近年来随着环境问题加剧、耕地面积减少,提高谷物产量已成为水稻生产的一个重大挑战。籽粒形状不仅决定粒重、影响水稻产量,而且影响稻米的品质和市场价值。随着现代分子生物学的发展以及水稻基因组测序的完成,越来越多的粒型调控基因在水稻中被克隆。然而,由于研究者对关键调控基因的分子机理知之甚少,加之实际育种过程中存在不良性状连锁等问题,已克隆的粒型调控基因的利用率并不高。因此,继续克隆调控粒型的关键基因,解析粒型调控的分子机理,对于培育高产、优质水稻新品种具有重要意义。本研究通过同源克隆的方式克隆了水稻粒型基因GW5L,它是粒宽主效QTL GW5的同源基因,编码一个膜定位的IQ蛋白。GW5L可以与GSK2蛋白激酶互作,并且通过抑制其磷酸化正向调控BR信号,从而影响籽粒形状;另外,GW5L还可以参与钙调素蛋白OsCaM1-1介导的抗盐反应。本研究对GW5L基因的结构与功能等做了研究与分析,主要结论如下。1.采用同源克隆方式,以GW5编码的蛋白序列为参照在水稻基因组中克隆了GW5L基因。由于所编码蛋白结构高度一致,推测GW5L和GW5有相似的生物学功能。转基因实验发现,GW5L过表达植株表现出典型的BR过量表型,包括植株变矮、叶夹角变大、籽粒变细长等;GW5L敲除家系出现籽粒变宽变短的表型。因此,GW5L是一个粒宽的负调控因子。2.BR是重要的植物激素,在水稻中发挥着重要功能。叶夹角BR敏感性实验证明,GW5L过表达家系的表型是由于BR信号的增强引起的。GW5L过表达转基因植株的qRT-PCR分析显示,D2、D11、Dwarf4等具有反馈调节效应的BR合成基因在GW5L过表达转基因植株中的表达有所下降。因此,推断GW5L通过BR信号途径影响粒型形成。3.为验证GW5L是否与GW5的互作蛋白GSK2互作,进行了酵母双杂、双分子荧光互补(BiFC)以及体外Pull-down实验,结果证实GW5L与GSK2确实存在互作关系。体外磷酸化实验进一步证明GW5L可以抑制GSK2自身磷酸化及磷酸化下游BZR1转录因子,并确定了GW5L在BR信号网络中的位置。GW5L通过抑制下游蛋白激酶GSK2的功能来调控BR信号传递,最终影响籽粒大小。4.酵母双杂交和BiFC实验均证实GW5L与钙调素蛋白OsCaM1-1互作,而OsCam1-1参与ABA介导的盐胁迫抗性,据此推测GW5L与水稻抗盐性相关。盐胁迫处理实验显示,GW5L过表达家系对盐胁迫更加敏感。qRT-PCR结果显示GW5L过表达家系盐敏感度的提高是由于OsCam1-1的表达量下降引起。GW5L与OsCam1-1介导的盐胁迫抗性有关,为揭示IQ蛋白与盐胁迫的关系提供了线索。5.GW5L与GW5具有相似的蛋白结构和生化功能,但基因表达模式存在差异。与GW5在穗部高表达相比,GW5L在被检测的各器官中表达水平均较高。这暗示着二者很可能在不同的组织中调控不同代谢途径。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S511
【图文】：

示意图,水稻籽粒,途径,细胞伸长

中国农业科学院博士学位论文第一章引言3图1.1 调控水稻籽粒大小关键基因调控模式图（Li et al., 2018）。Figure 1.1 A schematic representation illustrating major regulatory genes that control seed size.水稻的籽粒大小是由水稻小穗颖壳中细胞的分裂与伸长调控。调控水稻籽粒大小的代谢途径有：泛素蛋白酶体途径（UPS）、G 蛋白途径、MAPK 途径、植物激素途径、转录因子途径等。图中正向调控因子与反向调控因子分别用红色与绿色表示。调控细胞增殖的元件位于示意图左侧，用绿色分开；调控细胞伸长的位于示意图右侧，用黄色虚线分开；那些既调控细胞增殖又调控细胞伸长的元件位于绿色与黄色虚线之间。星号表示该元件的调控模式没有得到准确的验证。标尺=1 mm。The grain size of rice is regulated by cell proliferation and cell expansion in the glume of rice spikelets. The metabolic pathways regulatingrice grain size include: ubiquitin-proteasome (UPS) pathway, G-protein signaling, MAPK signaling, phytohormones and transcriptionalregulatoryfactors. The positive and negative regulators in the figure are shown in red and green respectively. The originals that regulate cellproliferation are located on the left side of the diagram, separated by green dotted lines; the cells that regulate cell elongation are on the right sideof the diagram, separated by yellow dotted lines; those that regulate cell proliferation and regulate cell elongation are located between green andyellow dashed lines. The asterisk indicates that the original control mode has not been accurately verified

模型图,籽粒大小,模型

生物体生长发育过程中，经常需要自行降解一些无用蛋白或需要调节的蛋白，以实现对特的生命活动的精确调控，从而有效调节蛋白的生命周转，循环利用生命原料。泛素化是细胞内种特异性的修饰，可以作为一种标签将被选择降解的蛋白标记，该过程涉及泛素、启动酶系统（E1、E2 和 E3）以及蛋白酶体系统(Pickart and Eddins, 2004)。最近的研究证明泛素降解途径在稻粒型调控中也发挥着重要作用，目前已克隆的泛素依赖性蛋白降解途径水稻粒型调控基因包GW2、TUD1、HGW 等。GW2 (GRAINWIDTH 2)是一个控制粒宽及粒重的主效 QTL，位于第 2 号染色体。Song 等（20年）利用由大粒粳稻品种 WY3 和小粒籼稻品种丰矮占 1 号构建的遗传群体图位克隆到该基因GW2 编码一个 E3 泛素连接酶，通过参与细胞分裂相关蛋白的泛素化降解过程，从而影响水稻壳细胞分裂，调控水稻籽粒大小（图 1.2）。GW2 功能缺失导致籽粒变宽，但不影响胚乳细胞数目只是导致胚乳细胞变大，这说明 GW2 通过不同的机制控制颖壳及胚乳的发育。gw2 在增加颖大小的同时提高灌浆速率和干物质积累，因此对稻米品质的影响不大，不会导致高垩白等负面状，在优良稻米品种选育中具有较高的利用价值(Song et al., 2007)。

细胞伸长

该基因表达产物定位在细胞核中，并且其表达受到生长素的调节。SMOS1 可细胞扩增相关基因 OsPHI-1 的启动子并调控其表达(Aya et al.,2014)。最近有报道证明，SM与 BR 信号途径传导蛋白 DLT 互作，并且二者同时存在时可促进下游基因 OsPHI-1 的表达，SMOS1 与 DLT 形成了一个关键复合体，共同响应水稻中生长素与 BR 信号，为解释水同激素的信号交联提供了依据(Hirano et al., 2017)。GL4 是非洲稻中一个调控粒型的主效基因，可通过调控外稃与Qg稃中细胞大小来影响籽小。GL4 不仅影响籽粒的大小，同时又影响落粒性，这一点与其在亚洲稻中的同源基因同。GL4 与 SH4 编码区中一个 SNP 导致翻译的提前终止，最终导致了小粒与落粒性增强。GL4 的克隆为研究非洲稻的驯化奠定了基础，同时为水稻优质高产育种提供了新的材料(W, 2017)。OsBUL1 (BRASSINOSTEROID UPREGULATED 1-LIKE1) 编码一个非典型的 Helix-loop-helix)类转录因子，其表达量受 BL 的诱导，功能缺失后会出现叶夹角减小，籽粒表型。OsBUL1 可以与未知蛋白 LO9-177 以及另一个 bHLH (basic helix-loop-helix)蛋白 Os成转录复合体，共同调控细胞的伸长以及籽粒的大小（图 1.4）。同时，OsBC1 的表达也的诱导且功能缺失后出现与 OsBUL1 突变类似的表型。OsBUL1 与 OsBC1 的克隆对于H-bHLH 复合体代谢及其调控细胞伸长、籽粒大小的分子机理打下了基础(Jang et al., 2017

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