家蚕ShxA、ShxC1基因启动子鉴定及表达调控研究

发布时间：2020-07-26 19:55

【摘要】：基因表达调控是生物体正常发育和生命活动的分子基础,是当今分子生物学研究的中心问题之一。Hox(homeotic genes)是一类古老且广泛存在于生物体内的发育调控基因,该类基因功能的缺陷通常导致胚胎期致死或器官的同源异型转化。Hox基因在漫长的生物演化中高度保守,且极少发生基因复制和扩增现象。有学者发现,在昆虫中Hox基因发生过基因复制和扩增现象,特别在鳞翅目昆虫中发现pb和zen之间扩增产生一簇(4~15个)具有保守Homeobox结构域的Hox基因簇相关基因,即Shx(Special homeobox genes)。家蚕是重要的经济昆虫,已有几千年的驯养历史。随着家蚕全基因组测序的完成和29个家蚕品系基因组重测序数据的公布以及转录组和蛋白组数据等的逐渐完善,为家蚕的后基因组研究提供了坚实的基础。近些年生物技术快速发展,在家蚕中利用转基因技术对基因功能及基因表达调控的研究也日益普遍。同时,由于Hox基因具有重要的发育调控功能,Shx基因作为鳞翅目昆虫Hox基因簇扩增产生的新基因具有重要研究价值。本小组对家蚕Shx基因的前期研究中,完成了Shx基因的鉴定和表达模式分析,发现在家蚕中存在5个Shx基因,即BmshxA、BmshxB1、BmshxB2、BmshxC1和BmshxC2,这5个基因的表达模式高度一致。在幼虫期它们均只在家蚕卵巢中特异表达,成虫期仅在雌蛾卵内特异表达。原位杂交实验显示Bmshx基因特异在幼虫卵巢和成虫期卵的滤泡细胞表达,推测其与浆膜发育有关。由于Shx这类基因是Hox基因簇中新鉴定到的基因,其对卵巢或卵发育行使的具体功能及分子调控机制尚不清楚。本研究选择家蚕ShxA和ShxC1基因进行研究。首先通过生物信息学、基因克隆和转基因的方法对这两个基因的启动子进行鉴定,再利用蛋白与DNA结合性实验,钓取与BmshxA基因上游序列特异结合的反式因子,筛选参与BmshxA基因表达调控的反式作用因子,并初步探究反式作用因子对BmshxA调控的分子机制。对家蚕Shx基因的研究,可为研究Hox基因簇新基因的功能、昆虫卵巢及卵子发育的调控机制提供重要参考。本文主要研究结果如下:1.家蚕ShxA、ShxC1基因启动子鉴定通过生物信息学对BmshxA、BmshxC1基因潜在的启动子序列进行转录因子结合位点预测和分析,然后截取BmshxA基因起始密码子上游934 bp和1619 bp以及BmshxC1基因起始密码子上游1656 bp的DNA序列为候选启动子片段,构建三个候选启动子片段驱动红色荧光蛋白基因(DsRed)的piggybac转基因表达载体。在家蚕野生型品系大造的胚胎早期进行显微注射,孵化后饲养、传代和筛选转基因阳性个体,最终得到标记为BmshxA-934、BmshxA-1619、BmshxC1-1656的三个转基因系。进一步对转基因系插入位点进行分析,未发现转基因片段插入基因外显子而导致基因结构和功能破坏的情况。对转基因个体进行观察,未发现其在取食、运动及交配产卵过程中存在异常。为了分析截取的候选启动子的活性,我们调查转基因个体卵巢中红色荧光蛋白基因DsRed的表达情况,结果发现其在mRNA水平和蛋白水平均能被检测到,这表明截取的BmshxA-934、BmshxA-1619、BmshxC1-1656片段具有启动子活性。进一步,我们比较了BmshxA-934和BmshxA-1619片段的启动效率,发现BmshxA-1619的启动效率显著高于BmshxA-934,暗示BmshxA基因起始密码子上游935-1619 bp可能含有增强基因表达的元件或反式因子结合位点。2.家蚕ShxA基因上游反式作用因子筛选和功能研究由于转基因系中BmshxA-934和BmshxA-1619片段启动DsRed基因表达的活性存在显著差异,结合对截取的启动子序列转录因子结合位点的预测分析,我们选取BmshxA基因起始密码子上游1344 bp至1626 bp共282 bp为探针,通过DNA pull down实验钓取与探针结合的反式因子,对DNA pull down洗脱液进行电泳检测发现实验组和对照组有两条差异条带,对差异条带进行质谱鉴定和分析,在实验组鉴定到8个与探针特异结合的蛋白,对这8个蛋白进行功能注释,调查这8个蛋白编码基因的表达模式并分析其与BmshxA基因同时期表达模式的相关性。筛选得到两个表达极相关的基因,分别编码复制蛋白A大亚基和核转运蛋白α亚基。为进一步探究编码复制蛋白A大亚基和核转运蛋白α亚基基因对BmshxA基因的表达调控机制,我们在刚化蛹时期,利用靶向的双链RNA对这两个基因进行干涉实验,检测干涉目的基因的表达和BmshxA基因的表达情况。干涉编码复制蛋白A大亚基基因,在该基因表达下调个体中检测BmshxA基因的表达存在下调现象;干涉核转运蛋白α亚基基因,检测该基因表达有下调,并检测到BmshxA基因表达显著上调,暗示核转运蛋白α亚基基因可能对BmshxA基因表达有抑制作用。在本研究中,我们成功构建了BmshxA-934、BmshxA-1619、BmshxC1-1656三个转基因系,并证明截取的三个片段均具有启动基因表达的活性。利用DNA pull down和质谱技术鉴定得到与BmshxA基因上游序列结合的8个蛋白,其中重点关注两个蛋白即复制蛋白A大亚基和核转运蛋白α亚基,对这两个蛋白编码基因进行双链干涉,发现核转运蛋白α亚基可能是BmshxA基因的负调控因子,抑制BmshxA基因的表达,可能参与调控BmshxA对卵巢或卵的发育。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78;S881.2
【图文】：

序列,后生动物,真核生物,启动子

图 1.1 简单真核生物和后生动物启动子比较[2]a 简单真核生物转录单元；b 后生动物转录控制模块。 1.1 Comparison of a simple eukaryotic promoter and extensively diversified meregulatory modules[2]a. Simple eukaryotic transcriptional unit. b. metazoan transcriptional control modules.序列包含启动子近端元件（promoter Proximal element）、上游激am activator sequence, UAS）、增强子（enhance）、沉默子（silencsulator）等[4]。启动子近端元件顾名思义是紧邻启动子的一段 DN质结合招募增强子至核心启动子区从而调控基因的转录[8, 9]。在在类似增强子作用的元件即上游激活序列，其位于启动子 TATA录激活因子而使启动子具有某专一性转录激活能力[4]。增强子长00 bp 之间，与结合蛋白作用，可增强基因的转录。增强子增强向性和位置性，既可以作用于上游的靶基因，也可以作用于下游靶靶基因内含子区域，也可位于靶基因几百万碱基对之外[10]。且调控多个基因的表达，一个基因也可同时受多个增强子调控，靶

序列,核心启动子,序列模式

西南大学硕士学位论文基因转录有较强激活作用的CAAT框，其保守序列为GGCT-CAATCT，若游存在 CAAT 框可大幅提高基因表达；GC 框主要位于转录起始位-23 bp 处，可结合调节蛋白 SP1[34]。这些 DNA 序列即为核心启动子上动子依据其调控基因转录的模式可分为 3 类：（1）组成型启动子（consoter），该类启动子调控的基因广谱性地在所有组织中表达，其表达模式境的影响很小，且在各组织器官和各发育阶段表达量基本保持恒定，如蛋白启动子[35]；（2）组织特异型启动子（tissue-specific promoter），是指在特定组织表达的启动子，可使目的基因表达产物在一定组织部位中积发育调节的特性，如昆虫生殖细胞特异表达的 vasa 启动子[36]；（3）诱（inducible promoter），其在某些特定的物理或化学信号的诱导下可大基因的转录水平，没有被诱导时基因表达水平很低甚至不表达，如热休高温诱导下表达水平显著升高[37]。

序列,上排,基因表达,基因组

于染色体近端；而调节身体偏后端体节的基因，位于染色体上偏远端[49]。在胚胎发育过程中，Hox 基因的表达按照在基因组染色体上由 3’-5’的顺序依次表达，调控体轴近端的基因也即靠近 3’端的基因先表达，调控体轴远端发育的基因也即靠近 5’端的基因后表达[57]。2）后部优势（posterior prevalence）调控。在研究鼠类脊椎骨同源异型转化时研究者认为，体节形态可能是由多个 Hox 基因共同作用的结果，当一些 Hox基因产生突变就会打破这些 Hox基因相对应区域的调控，导致表型的异常[58]。为了更好的阐释脊椎动物肢体形成是怎样受 Hox 基因的调控，后部优势这一模型被提出，即 Hox基因在基因组上按 3’-5’的顺序排布，越靠后的基因表达更有优势，其能抑制排列靠前基因的表达[59, 60]。3）体节形成决定性调节和剂量效应。在果蝇腹部肢体形成中，Ubx 和 abd-A 基因通过抑制 Distalless 使得腹部肢体不能形成，Hox 基因对体轴和肢体的发育形成起到决定性作用[61]。剂量效应是在许多基因调控中均存在的，Hox 基因调控也存在剂量效应。在鳞翅目昆虫家蚕中 BmUbx 基因以剂量效应来影响突变体 EKh-l（ Kh-extra-crescents-like ）和 Ecs-l （supernumerary crescents and legs-like）异位长腿的形态[62, 63]。

【参考文献】