Itpr1基因突变引起小鼠瞳孔散大及其分子机制研究

发布时间：2020-07-28 07:21

【摘要】：乙烷基亚硝基脲(ENU)是目前公认的最有效的小鼠诱变剂之一。利用ENU可以在短期内获得大量突变小鼠从而建立人类疾病的小鼠模型进而用于相关疾病发生机制的研究。本文在ENU诱变获得一例瞳孔散大小鼠Dp2(Dilated pupil mutation 2)模型基础上,成功定位与鉴定引起该表型的突变基因并对该表型发生原因进行研究分析。现汇报如下:1 ENU诱变获得Dp2瞳孔散大小鼠模型通过注射ENU诱导小鼠突变手段,获一例大瞳孔杂合子小鼠Dp2,当用光照射小鼠眼球时瞳孔无明显缩小。本文以此大瞳孔小鼠为研究对象,将该小鼠与野生型B6小鼠配种,观察并记录770只后代,其中359只小鼠具有大瞳孔表型,且该表型在小鼠4周龄(4W)左右恢复。组织学分析Dp2小鼠眼球发现,小鼠虹膜未见明显缺损。毛果芸香碱不能使该表型小鼠瞳孔缩小。以上结果显示:Dp2小鼠大瞳孔表型是由瞳孔括约肌收缩缺陷引起的瞳孔散大。2 Dp2小鼠突变基因的定位与鉴定将B6背景瞳孔散大杂合子小鼠与野生型D2小鼠配种获得Fl代瞳孔散大小鼠,F1代小鼠回交B6获得[(B6 X D2)X B6]N2代小鼠,筛选出具有瞳孔散大表型的N2代小鼠用于突变基因的定位。基因连锁分析显示:突变基因与微卫星D6Mit230连锁(LOD值12.92),初步将该基因定位于小鼠第6号染色体上。为对该突变基因进行精确定位,增加N2代小鼠数量并在小鼠第6号染色体上增加微卫星密度。最终,突变基因被确定在D6Mit149和D6Mit148之间,即遗传距离48.93 cM-51.53 cM之间。在精确定位区间,MGI数据库报道有10个蛋白编码基因(Arl8b、Bhlhe40、Crbn、Edem1、Il5ra、Itpr1、Lrrn1、Setmar、Sumf1、Trnt1)和两个未分类的非编码RNA基因(0610040F04Rik、Gm17055)。对以上基因序列进行测序对比后发现,除Itpr1基因外,其他基因未发现突变。对Itpr1基因编码区测序发现,该基因编码区第5927位核苷酸发生由G到A的转换,蛋白预测发现,该突变可引起其编码蛋白IP3R1第1976位氨基酸由半胱氨酸转变为酪氨酸。3Dp2瞳孔散大机制的研究以 Anti-IP3R1、Anti-Myosin light chain(phospho S20)及 Anti-GRP78 BIP 抗体为一抗,采过免疫组织化学技术对未恢复(2 W)和恢复(4 W)的Dp2小鼠及同窝野生型小鼠瞳孔括约肌进行分析,结果发现:与野生型小鼠相比Dp2小鼠IP3R1水平未见明显差异,Itpr1基因的突变不影响IP3R1蛋白的表达;未恢复(2 W)Dp2小鼠Myosin light chain的磷酸化水平明显低于野生型小鼠,平滑肌收缩活动受到抑制,恢复(4 W)的Dp2小鼠Myosin light chain的磷酸化水平与野生型小鼠未见明显差异,平滑肌收缩能力恢复正常水平;未恢复(2W)Dp2小鼠BIP水平明显高于野生型小鼠,此时存在未折叠蛋白反应,恢复(4W)的Dp2小鼠BIP水平与野生型小鼠未见明显差异。结论:本文使用ENU诱变获得一例瞳孔散大小鼠,基因定位及鉴定发现该表型是由Itpr1突变引起。进一步研究结果显示Itpr1突变可引起内质网未折叠蛋白反应,使得部分IP3R1蛋白功能暂时性丧失,导致瞳孔括约肌收缩障碍,从而引起小鼠临时性瞳孔散大表型。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78
【图文】：

胞内的调节剂（如钙、钙调节蛋白、ＡＴＰ、Ｃａｒ８）邋［２２别和几种蛋白激酶（如ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＣａＭ逡逑激酶ＩＩ等）磷酸化［２４？］的调节；（３）含有六个跨膜结构域（ＴＭＤ）的区域；（４）与多种逡逑调节蛋白相互作用的Ｃ端胞质尾部％３（）］（图１）。突变型ＩＰ３Ｒ１对通道活性的影响取决于逡逑突变的严重程度、位置以及四聚体通道内组装的突变亚基的含量（该四聚体通道的三维结逡逑构可使用单粒子冷冻电镜确定）【３１］（图２）。有学者认为，这些突变多发生在新生儿中，逡逑发挥显性负效应并破坏细胞Ｃａ２＋稳态１３２］。逡逑

２．１大瞳孔表型小鼠的获得和遗传试验结果逡逑本实验室通过ＥＮＵ诱变获得多种突变表型小鼠，如角膜混浊、多趾、卷尾等，其中逡逑一种小鼠表现为在强光照射和毛果芸香碱滴眼时仍为大瞳孔（图１．１邋Ｂ），而正常小鼠在同逡逑等条件下瞳孔缩小（图１．１邋Ａ），该突变小鼠被初步命名为Ｄ／７２邋（Ｄｉｌａｔｅｄ邋Ｐｕｐｉｌ邋２）。将逡逑小鼠与野生型Ｂ６小鼠配种，共获得７７０只后代小鼠，其中３５９只小鼠表现为大瞳孔表型。逡逑Ａ邋：，，，：Ｂ逡逑Ｌ』：＇＇邋ｉｉ逡逑图Ｍ野生型及小鼠逡逑Ｆｉｇ邋１．１邋Ｗｉｌｄ邋ｔｙｐｅ邋ａｎｄ邋Ｄｐ２邋ｍｉｃｅ逡逑Ａ：野生型小鼠邋Ｂ：逦小鼠逡逑Ａ：邋Ｗｉｌｄ邋Ｍｏｕｓｅ邋Ｂ：邋Ｄｐ２邋Ｍｏｕｓｅ逡逑２．２组织学分析结果逡逑对小鼠眼球石蜡切片后使用Ｈ．Ｅ染色观察，结果显示野生型及你２小鼠虹膜结构完整，逡逑可见虹膜基质和明显的瞳孔括约肌。但瞳孔恢复前（２Ｗ）（图１．２邋Ｂ）与同龄野生型Ｂ６逡逑小鼠（图１．２Ａ）相比虹膜较短，而瞳孔恢复后（４Ｗ）（图１．２邋Ｄ）虹膜与同龄野生型Ｂ６逡逑小鼠（图１．２邋Ｃ）无明显差别。除此之外正常小鼠与小鼠晶状体和角膜无明显差别。逡逑

现除／／ｐｒ／基因外，其他基因未发现碱基突变。逡逑对多个杂合子小鼠／／ｐ〃／基因重复测序发现：Ｚ）ｐ２小鼠你Ｗ基因编码区的第５９２７逡逑位核苷酸发生由Ｇ到Ａ的转换（图２．２Ａ），而本实验室饲养的野生型Ｂ６，Ｄ２，邋ＢＡＬＢ／ｃ，逡逑１２９小鼠测序结果与数据库一致。逡逑蛋白预测发现该突变引起／中ｒ／基因编码区第１９７６位氨基酸由半胱氨酸转变为酪氨逡逑酸，且该氨基酸在不同动物中高度保守（图２．２Ｂ）。逡逑

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本文编号：2772536