大白菜BrSKS13基因在花粉发育中的功能鉴定

发布时间：2020-07-27 20:35

【摘要】：大白菜是异花授粉作物,杂种优势明显,杂交制种已成为国内外大白菜抗病、优质、稳产育种的首要措施。前期通过抑制差减杂交技术(SSH)在大白菜雄性不育两用系‘A02’中找到一段有显著性差异的基因片段,通过NCBI比对,发现与拟南芥SKS13(At3g13400)同源性最高,故命名为BrSKS13。本研究通过qRT-PCR,原位杂交进行表达模式分析预测了BrSKS13的生物学功能;通过对拟南芥同源缺失突变体sks13花粉表型及花粉萌发等实验鉴定了该基因的功能;将BrSKS13基因转入拟南芥同源缺失突变体sks13,进一步验证功能恢复。主要结果如下:1.为了确定BrSKS13的时空表达模式,利用RT-PCR技术分析了它在大白菜可育株和不育株的根、茎、叶和花蕾中的表达情况,发现在可育株花蕾中有较高表达;又对该基因在可育花蕾的花瓣、花萼、花药和雌蕊中的表达情况进行分析,发现在花药中有较高表达;进一步分析该基因在花药六个等级中的表达情况,发现表达量随着花药等级的增加表现为上调。表明BrSKS13是花蕾发育相关基因,可能参与花药的发育。应用qRT-PCR分析可育5级花蕾向不育株授粉0h,1h,2h,4h,8h,12h,16h和24h后的嫩角果,发现BrSKS13仍能持续表达,并且随着授粉时间的推移表达量先下降,当达到4h时,表达量迅速增加,而后又下降。进而应用原位杂交技术对BrSKS13进行分析,在授粉后的柱头中能检测到该基因,表明该基因参与花粉管的生长。2.从TAIR网站上购买了拟南芥突变体sks13,采用“三引物法”鉴定出纯合突变体。通过对纯合突变体表型的观察,发现与野生型拟南芥相比,突变植株在营养生长阶段与野生型没有明显的差异,当进入生殖生长阶段时,突变体植株略显矮小,抽薹数量比较少,说明SKS13的缺失可能影响了拟南芥某些生殖发育过程。通过观察纯合突变体花粉粒表型和花粉萌发实验,发现拟南芥SKS13的缺失会导致少数花粉发育不良,花粉不能正常萌发。进而对突变体的结荚情况进行观察,发现与野生型相比,突变体的结荚率比较低,且角果长度较短,却略显粗壮,表明SKS13的缺失影响了拟南芥的正常结荚。3.利用构建的过表达载体,通过根癌农杆菌介导转化法,把BrSKS13基因转入拟南芥纯合突变体sks13中,并筛选出转基因植株。BrSKS13基因在拟南芥中的表达模式分析可见,转BrSKS13的拟南芥在花药上出现GUS信号,说明BrSKS13与花药发育相关。对转基因植株,纯合突变体和野生型进行观察,发现转基因植株与突变体相比,抽薹数量增多、结荚数目增加、角果长度增长、花粉正常发育、种子数量增多等,而与野生型没有明显的差异。这说明BrSKS13的插入可以使突变体的表型恢复。综上所述,BrSKS13可能参与了花粉发育和结荚等过程。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S634.1
【图文】：

沈阳农业大学硕士学位论文可育和不育株各个组织的表达’可育株和不育株的须根、块根、茎、叶和花蕾为材料按及反转录成 cDNA 进行 RT-PCR 分析，结果如图 2-2 所的花蕾的表达量较高，条带比较清晰且明亮；然而在不他部位（花蕾除外）条带比较微弱或没有条带，表明目或没有表达。而 Brlact7 基因在可育株和不育株的任何似，表明 Brlact7 基因在这些材料中表达没有差异，表因的内参是可靠的。说明 BrSKS13 在可育株花蕾中表达量较低，几乎不表达是可靠的，是育性相关基因。M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

可育株和不育株各级花药的表达2’可育株和不育株的Ⅰ-Ⅵ级花药，获取其 cDNA，如图 2-4 所示，Brlact7 基因大白菜植株的各级花药可育株各个分级的花药中均表达比较明显，并且随 BrSKS13 在花药的发育过程中持续表达并推测 B 2-3 BrSKS13 和 Brlact7 在可育株 各个花器官的 差异ent expression of BrSKS13 and Brlact7 in different fertile plants00 marker；1、2、3、4、5，分 别 为 可 育 植 株 的 花 丝 、 花 瓣 、ote: M, DL2000 marker; 1, filaments; 2, Petals; 3, Sepals; 4, Pistils; 5, StM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

育株和不育株各级花药的表达可育株和不育株的Ⅰ-Ⅵ级花药，获取其 cDNA，做如图 2-4 所示，Brlact7 基因大白菜植株的各级花药中可育株各个分级的花药中均表达比较明显，并且随着 BrSKS13 在花药的发育过程中持续表达并推测 BrS-3 BrSKS13 和 Brlact7 在可育株 各个花器官的 差异表t expression of BrSKS13 and Brlact7 in different flfertile plants marker；1、2、3、4、5，分 别 为 可 育 植 株 的 花 丝 、 花 瓣 、 花e: M, DL2000 marker; 1, filaments; 2, Petals; 3, Sepals; 4, Pistils; 5, StamM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 丛汉卿;徐立;信彩云;李志英;;植物漆酶的研究进展[J];安徽农业科学;2009年18期

相关博士学位论文 前1条

1 张_";十字花科植物BcMF2和BcMF4同源基因的克隆、表达及其进化关系研究[D];浙江大学;2005年

相关硕士学位论文 前2条

1 辛喜凤;复等位基因遗传大白菜核雄性不育相关基因的分离与表达分析[D];沈阳农业大学;2012年

2 张志仙;白菜花粉特异基因BcSKS11在花粉发育及授粉受精中的表达分析及功能鉴定[D];浙江大学;2011年

本文编号：2772345