东莨菪内酯对朱砂叶螨致毒作用的钙通道相关基因研究

发布时间：2020-07-28 17:44

【摘要】：本实验室通过筛选一系列化合物发现,源于植物黄花蒿的活性物质东莨菪内酯对朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)具有良好的触杀、趋避以及产卵抑制等活性,具有开发成绿色杀螨剂潜力,但是其杀螨的作用机制或者分子靶标仍不清楚。因此明确东莨菪内酯对朱砂叶螨杀螨作用的机制和分子靶标,为以东莨菪内酯为模板进行分子设计,开发高效、安全、具有新的作用靶标的杀螨剂提供理论依据,为创制拥有自主知识产权的新型绿色杀螨剂奠定基础。本论文以东莨菪内酯对朱砂叶螨致毒作用的钙离子通道相关基因为研究对象,进行了东莨菪内酯对朱砂叶螨杀螨机制相关基因及分子靶标鉴定的系统研究,取得了以下研究成果:1.获得并验证了数字基因表达谱测序结果,明确了东莨菪内酯处理下朱砂叶螨响应基因参与的主要生物学过程处理组和溶剂对照组测序分别得到52,496,305条和52,286,859条Reads。24 h和48 h的差异表达基因分别为15481条和15411条。满足偏离概率值≥0.8并且log2Ratio≥1的显著差异基因分别有70条和102条。此外,qPCR证实了mRNA测序结果的准确性,也说明参与验证的15条基因确实对东莨菪内酯发生了响应。Gene Ontology(GO)功能显著性富集分析明确了显著差异基因参与的主要生物学过程主要包括细胞生理过程、代谢过程、单生物过程、细胞凋亡、连接和催化活性、离子跨膜转运、神经传导等。KEGG通路富集分析罗列了24 h和48h富集程度排名前20的生化代谢途径和信号转导途径,其中磷脂酰肌醇信号系统、钙信号通路和MAPK信号通路是最具代表性的生化途径。这些GO条目和KEGG条目里所包含的基因很可能与东莨菪内酯杀螨机制密切相关。2.获得了与螨体代谢、钙信号传导等相关的显著差异基因,测定了东莨菪内酯处理下3条钙离子通道相关基因表达量变化通过RPKM(每百万reads中来自于某基因每千碱基长度的reads数)和Noiseq算法,筛选出两处理时间段的显著差异基因总条数为172条,共有基因为18条。本研究获得了获得了3条与钙离子通道密切相关的基因,如鸟苷酸激酶(GUK)、细胞凋亡蛋白(BAG)和G蛋白偶联神经肽受体(GPCR),其是重要的信号传导类基因也是差异表达比较明显的基因;qPCR进一步检测结果表明,东莨菪内酯处理上调TcGPCR的表达,下调TcBAG和TcGUK表达,其可作为以后东莨菪内酯杀螨作用机理研究的关键基因。3.克隆并分析了朱砂叶螨鸟苷酸激酶、细胞凋亡蛋白和G蛋白偶联神经肽受体基因基因的cDNA序列及其表达模式通过克隆获得了鸟苷酸激酶、细胞凋亡蛋白和G蛋白偶联神经肽受体基因cDNA序列,分别命名为TcGUK,TcBAG和TcGPCR,登录号分别是:KY660540、KY660539和KY660538。此外,通过序列比对、进化树分析、蛋白跨膜结构以及结构域预测,发现其同其它物种同源性基因具有较高的相似度,其与钙离子通道密切相关,是钙离子通道相关基因。对这些钙离子通道相关基因(TcGPCR,TcBAG和TcGUK)的不同螨态表达模式分析结果显示,其在幼螨和若螨阶段的表达水平均显著高于朱砂叶螨其他发育阶段。4.东莨菪内酯对朱砂叶螨致毒作用的分子靶标的鉴定通过RNAi技术鉴定东莨菪内酯的作用靶标,结果发现这3条钙通道相关基因都与东莨菪内酯的杀螨活性相关;也就是,下调TcBAG和TcGUK后增强了朱砂叶螨对东莨菪内酯的敏感性,下调TcGPCR后降低了朱砂叶螨对东莨菪内酯的敏感性。另外,我们成功的把TcGPCR在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)进行了功能表达,同时进行了细胞内钙离子流动的测定。药理数据结果表明,东莨菪内酯以浓度依赖性的方式强烈激活TcGPCR。同时,香豆素衍生物对TcGPCR有激动活性,且其活性位点为C-6,C-7,这表明香豆素类化合物可能具有相似的分子靶点。目前的研究结果可以明确GPCR敏感型钙离子释放通道可能是天然产物杀螨剂东莨菪内酯的首要作用靶标;同时,也不能排除其他钙离子通道相关基因:TcBAG和TcGUK作为东莨菪内酯杀螨剂作用靶标的可能性。此外,香豆素类杀螨活性化合物可能具有相同的分子靶标。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S481
【图文】：

流程图,信息分析,流程图,测序技术

第一章文献综述数字基因表达谱测序技术数字基因表达谱测序技术（RNA-Seq）是联合转录组测序的建库手段，在叶究某个特定的生物过程的差异表达基因，而且能够快速筛选和鉴定出一系列候东莨菪内酯杀螨机制研究尤为必要。用于检测基因表达的数字基因表达谱测序示，首先利用 RNA-Seq 测序，然后对基因表达差异进行解析，紧接着对差异ne Ontology 和 KEGG Pathway 富集分析，从而找到研究吻合的代谢通路相关终进行一系列实验验证，例如：基因克隆、基因敲除、RNAi、RT-PCR 等实验谱测序技术能够有效地阐明叶螨应对药物刺激后在基因水平上的响应和该基因的生理代谢过程以及信号传导通路等。目前，数字基因表达谱测序技术在叶螨剂抗性分子机制以及寄主互作机制的研究。因此，在朱砂叶螨响应东莨菪内酯制研究中，该测序方法能有效的挖掘响应的候选靶标基因，为阐明东莨菪内酯定基础。

作用机制,杀螨剂,东莨菪内酯

论文选题依据与研究内容.1 选题依据由于朱砂叶螨自身特性以及化学农药的抗性、环境污染、滥用等问题导致化学防治害螨经很难满足环境和治理等要求,因此，朱砂叶螨对我国的农林业生产带来重大危害。所以植源杀螨剂的研发正当其时，本实验室通过筛选发现东莨菪内酯对朱砂叶螨表现出较好的防效果，并且该化合物结构简单、稳定，利于储存，又能通过化学等方法合成，对非靶标类物安全，害螨不易对其产生抗药性，具有开发为绿色杀螨剂的潜力。除此之外，从研究害控制剂的角度出发，研究天然产物杀螨剂的最终目的，一是发现具有高度杀螨活性的先导合物；二是发现杀螨剂新的作用靶标，进而开发新型、绿色杀螨剂。然而，与大多数常规学杀螨药剂相比，东莨菪内酯的杀螨活性、药剂利用率仍然较低，要开发出与环境相容性、备高效杀螨活性的新型植物源杀螨剂，还需根据东莨菪内酯的靶标位点，利用化学合成等段对其进行结构修饰和改造，因此阐明东莨菪内酯的作用机制和靶标位点势在必行。图 1-3 dsRNA 作用机制Fig. 1-3 Mechanism of dsRNA

实验流程,异基因,差异表达

经过滤后得到总 clean reads，利用基因组比分析和差异基因筛选等各项分析，以此挖PCR 检测对测序结果准确度的验证，所以必须保证试著差异表达的基因，利用 Primer 3.0 (http://表 2-1 所示。采用 Sun[92]等人经实验证实表 2-1 实时荧光定量 PCR 引物le 2-1 Primers used in Real-time fluorescence q图 2-1 RNA-Seq 实验流程图2-1 Experiment pipeline of RNA-Seq in T. cinn

【参考文献】