食管鳞癌基因组拷贝数改变和多基因热点突变与临床病理因素的相关性研究

发布时间：2020-07-28 20:12

【摘要】：第一部分浅表食管鳞癌的全基因组拷贝数分析及其与肿瘤转移的相关性研究目的:浅表食管鳞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是一类预后较好的ESCC。内镜下黏膜切除术(Endoscopicmucosalresection,EMR)因其更安全和更好的保留食管结构,而作为浅表ESCC主要的治疗方式。然而,一部分接受EMR的浅表ESCC患者会因发生转移而导致预后不良,需要进一步接受外科手术治疗等。因此发现能够评估浅表ESCC转移风险的生物标记物是十分重要的。本研究的目的是通过全基因组拷贝数分析,找到能够识别高转移风险的浅表ESCC中拷贝数改变(Copy number alteration,CNA)。方法:本研究收集了于2004年到2010年期间在中国医学科学院肿瘤医院接受外科手术治疗的T1NOMO期ESCC病例38例。该38例样本中包括19例在术后五年内发生了转移和19例在术后五年内未发生转移的病例。使用Affymetrix OncoScan FFPE基因芯片技术对38例ESCC的样本进行全基因组拷贝数检测。并使用荧光定量PCR验证Oncoscan基因芯片的检测结果的一致性。结果:1.本研究发现了 39个基因CNAs的组合能够识别浅表ESCC的转移风险。使用非监督聚类对该39个基因的CNAs进行聚类,以区分浅表ESCC的预后状态,具有较高的准确性,其中有2个实际发生转移的患者和5个实际未发生转移的患者被误判。该39个基因包括FGF4、MRAS和CHEK1基因等。2.在全部检测样本中,分析发现了 28个显著的重复发生的CNAs,包括16个扩增和 12 个缺失。其中最显著的分别是 llq13.3(FGF4),3q28(TP63),14q21.1(FOXA1),8q24.21(MYC)的扩增和 9p21.3(CDKN2A),22q11.23(GSTT1),3p13(MITF),2q22.1(LRP1B)的缺失。3.在转移组样本中,分析发现了 8个显著的重复发生的CNAs,包括4个扩增和4个缺失。在未转移组样本中,分析发现了 14个显著的重复发生的CNAs,包括12个扩增和2个缺失。通过转移组与未转移组比较发现,3p26.33(SOX20T)、8q24.21(MYC)和14q21.1(FOXA1)的扩增以及3p12.1(GBE1)的缺失仅在转移组中发现为重复发生的CNAs。结论:通过拷贝数分析发现,39个基因CNAs的组合可能可以作为评估浅表ESCC转移风险的工具,除此之外还发现了3p26.33(SOXOTT)、8q24.21(MYC)和14q21.1(FOXA1)的扩增以及3p12.1(GBE1)的缺失浅表ESCC转移可能是驱动事件。第二部分靶向测序检测食管鳞癌中44个常见突变基因的热点突变及其与临床病理因素的相关性研究目的:相对于传统的化疗,癌症的靶向治疗特异性更强。识别癌症的靶向治疗的治疗靶点依赖于对癌症分子机制的了解及分子改变的发现。为了提高对食管鳞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC)的遗传学改变的理解,目前已有多项针对ESCC的全基因组或全外显子组二代测序研究的开展。虽然这些研究已经阐明了 ESCC的突变特征及在ESCC发生发展中起重要作用的基因,但是目前能够转化到ESCC临床应用中的基因组合十分有限。本研究的目的是尝试建立用于为ESCC患者提供预测预后及治疗靶点的生物标记物组合。方法:本研究纳入了从2004年到2009年于中国医学科学院肿瘤医院接受ESCC的外科手术治疗的119例ESCC病例,全部病例均有五年随访资料。根据已经发表的论文及 COSMIC(Catalogue of Somatic Mutations in Cancer)数据库,我们初步确立了 44个在ESCC中高突变频率的基因组合,包括了细胞周期调控基因、组蛋白修饰物基因和NOTCH信号通路基因等。进一步设计成针对Ion Torrent平台的测序引物。使用Ion Torrent PGM平台对119例ESCC病例的福尔马林固定石蜡包埋的组织进行靶向测序检测。结果:1.每个样本中平均突变个数是3个(0个-13个)。靶向测序结果中最常见的突变特征是发生在CpG二联核苷酸上的CT转换。2.119例样本中,共发现389个突变,其中包括21个重复发生的突变和255个仅发生了一次的突变。本队列高突变频率的基因依次为TP53基因(54.6%),其次是KMT2C(40.3%)、NOTCH1(35.3%)、PIK3CA(10.9%)、FAT1(10.1%)、CSMD3(9.24%)、FAT2(9.24%)和 KMD2T(9.24%)等。3.本研究中共检测到了 112个致病性或可能致病性的突变,以及160个意义不明的突变。在119例样本中,有14例患者可能可以作为潜在的靶向治疗的受益者。可以作为治疗靶标的重复发生的突变包括EGFR p.L858R(2/119)、BRCA2 p.R2842H(2/119)、PIK3CAp.E542K(4/119)、PIK3CAp.E545K(4/119)和 PIK3CAp.H1047R(2/119)。4.肿瘤的分化程度、KMT2C基因突变和ZNF750基因突变与ESCC的预后显著相关。这三个预后特征被进一步构建了一个预后的线阵图(C指数为0.673)和一个随机生存森林模型(预测错误率为0.3484),用于预测ESCC预后。结论:在本研究中,有11.8%(14/119)的ESCC患者可能可以接受靶向治疗的受益者。KMT2C基因突变和ZNF750基因突变是ESCC的预后影响因素。我们尝试初步建立了一个可以为ESCC患者提供预测预后及指导治疗的多基因组合。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.1
【图文】：

全基因组,拷贝数,染色体

逑２．邋３８例浅表ＥＳＣＣ的全基因组ＣＮＡ逡逑３８例浅表ＥＳＣＣ的全基因组ＣＮＡ概况如图１－１所示。在全部病例中，浅表ＥＳＣＣ逡逑的基因组存在普遍的ＣＮＡ。我们用ＧＩＩ用来量化评估基因组改变的程度。其中转移逡逑组和未转移组的２２条常染色体的ＧＩＩ如图１－２所示？。在未转移组中，ＧＩＩ最高的染逡逑色体包括８号染色体（７８．２％）、３号染色体（６５．７％）和２０号染色体（５９．８％），ＧＩＩ逡逑最低的染色体包括２１号染色体（２５．２％）、１２号染色体（２８．７％）和４号染色体（２９．５％）。逡逑在转移组中，ＧＩＩ最高的染色体包括３号染色体（７５．２％）、８号染色体（７２．１％）和逡逑１４号染色体（６０．０％），ＧＩＩ最低的染色体包括２１号染色体（３１．８％）、１５号染色体逡逑（３５．９％）和２２号染色体（３８＿１％）。通过ｔ检验比较发现，转移组的１８号染色体的逡逑ＧＩＩ显著高于未转移组（ｐ邋＝邋０．０３）（见图１－３Ｂ）。权重后的ＧＩＩ用来评估全基因组的逡逑拷贝数改变水平。全部样本的权重后的ＧＩＩ的平均值是４５．５％，未转移组样本的权逡逑重后的ＧＩＩ的平均值是４１．１％。转移组样本的权重后的ＧＩＩ的平均值是４９．９％，二逡逑者无统计学差异（ｐ＞0．0５）（见图１－３Ａ）。逡逑３２逡逑

拷贝数,基因,缺失,样本

３．在转移组和未转移组中的重复发生的拷贝数改变逡逑通过ＧＩＳＴＩＣ２．０分别分析全部３８例样本、其中的１９例发生转移的样本和１９例未逡逑发生转移的样本，三种情况的拷贝数改变谱如图１－４所示。逡逑在３８例样本中，通过ＧＩＳＴＩＣ２．０分析发现了邋２８个显著的重复发生的局灶水平的逡逑ＧＩＩ，包括１６个拷贝数扩增和１２个拷贝数缺失，具体ＣＮＡ如表２所示。发生次数逡逑最高的扩增包括邋ｌｌｑｌ３．３邋（ＦＧＦ４邋基因）、３ｑ２８邋（ＴＰ６３邋基因）、１４ｑ２１．１邋（Ｆ０ＸＡ１邋基逡逑因）和８ｑ２４．２１邋（ＭＹＣ基因），如图１－５Ａ所示。发生次数最高的缺失包括９ｐ２１．３逡逑（ＣＤＫＮ２Ａ邋基因）、２２ｑｌｌ．２３邋（ＧＳＴＴ１邋基因）、３ｐｌ３邋（ＭＩＴＦ邋基因）和邋２ｑ２２．１邋（ＬＲＰ１Ｂ逡逑基因），如图１－５Ｄ所示。其中，ｌｌｑｌ３．３邋（ＦＧＦ４基因）和８ｑ２４．２１邋（ＭＹＣ基因）逡逑的扩增以及９ｐ２１．３邋（ＣＤＫＮ２Ａ基因）和２ｑ２２．１邋（ＬＲＰ１Ｂ基因）在其他研究中己被报逡逑道发生在食管鳞癌中。而３ｐｌ３邋（ＭＩＴＦ基因）和２２ｑｌｌ．２３邋（ＧＳＴＴ１基因）的缺失在逡逑其他研究中并未发现。逡逑Ａ．逦Ｂ．逦Ｃ逡逑１邋ｆ邋￣－逦＝１－１邋Ｉ逦１逦￣一邋￣＾逦１逦ｒ邋＾邋＾逦一邋V、１逡逑１１１°？逦，－Ｆ逦１＇。卜－—Ｔ邋：邋ＳＥ逦ｉＶ！邋－逡逑１２逦ｌＴ邋－逦１２逦＝逦１２逦￣逡逑ｐ逦１：－－－＾－＇逦＿逦ｉ；逡逑ｌ；ｌ邋－ｉ邋ｉ＼ｒ－邋－｜；１邋－１逡逑图１－４．在全部样本中、发生转移的样本中以及未发生转移的样本中的拷贝数改变

样本,监督聚类,拷贝数,聚类

该３９个基因的拷贝数被进一步用来通过分监督聚类分析，能够将３８例样本较准确逡逑的分成两组，其中有２个发生转移的样本和５个未转移的样本被错误的分类。具体逡逑聚类结果如

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