水稻黄化转绿突变基因gry340的图位克隆与功能研究

发布时间：2020-07-28 21:41

【摘要】：叶绿体是植物进行光合作用的细胞器,叶绿体的发育与光合色素合成和光合作用有密切相关。水稻是单子叶模式植物,在水稻中叶色突变是比较常见的现象,因此水稻叶色突变材料是研究单子叶植物中光合色素合成与降解、叶绿体的发育以及结构功能、光合作用以及光形态建成的理想材料。本研究利用EMS(ethyl methane sulfonate)诱变粳稻品种日本晴获得的黄化转绿突变体gry340,并对gry340突变体进行了表型特征调查,光合色素的测定,以及叶绿体和线粒体超微结构的观察;然后对该突变体进行了分子标记定位、图位克隆、亚细胞定位、转基因互补验证等分析;最后利用qRT-PCR等技术进一步探讨了gry340突变基因的分子机理。主要研究结果如下:水稻gry340突变体在3叶期以前呈现黄化表型,以后随着植株生长发育逐渐转绿,到9叶期基本恢复到野生型的正常绿叶表型。gry340突变体的抽穗期延迟约9天,成熟后它的株高、单株有效穗、每穗粒数、穗长、结实率和千粒重分别比野生型减少10.9%、15.2%、25.1%、7.8%、21.7%和7.0%。不同发育时期的光合色素测定结果显示,gry340突变体在3叶期的Chl a、Chl b、Chls和类胡萝卜素的含量分别较野生型减少了67.6%、83.3%、71.7%和52.1%。随着植株的生长,gry340突变体的Chl a、Chl b、Chls和类胡萝卜素含量迅速增加,到9叶期和孕穗期时Chl a、Chl b、Chls和类胡萝卜素的含量与野生型的差异不显著。在23℃和30℃下gry340突变体幼苗均表现为黄化表型,其Chl a、Chl b、Chls和类胡萝卜素的含量与野生型相比均显著减少。上述表明gry340突变体中光合色素的变化是引起gry340突变体黄化转绿表型的直接原因,该突变体是一个对温度不敏感的叶色突变体。透射电子显微镜结果显示,gry340突变体在3叶期叶绿体数量与野生型相比无明显的差异,但是突变体中的叶绿体内呈现出丝状的类囊体结构,没有明显的基粒垛叠,显示叶绿体明显发育不良。此外,在gry340突变体中线粒体的形态不正常,呈现出明显的空泡状结构,说明线粒体发育也受到明显的抑制。在gry340突变体转绿后,叶绿体和线粒体的发育恢复正常。遗传分析表明该黄化转绿突变性状是受一对隐性核基因控制的。以gry340突变体与籼稻品种“明恢63”杂交得到的F_2作为定位群体,将gry340突变体精细定位于水稻第一染色体长臂上的InDel标记C4和C5之间的84 kb区域,该区域含有16个预测基因。候选基因测序结果显示,gry340突变体中LOC_Os01g58790基因的DNA序列在2554位(对应的CDS在575位)由胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T),从而造成所编码的蛋白在第192个氨基酸发生突变,即GCT(丙氨酸ala)突变成GTT(缬氨酸Val)。该基因预测编码GHMP激酶家族的IspE(4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D赤藓糖醇激酶)。因此将该基因确定为导致gry340黄化转绿突变表型的候选基因,命名为OsIspE。OsIspE在水稻中是单拷贝基因,DNA和cDNA全长分别为4834 bp和1206 bp,编码分子量约为43.8 kDa的蛋白质。水稻OsIspE与单子叶植物大麦、玉米和高粱的同源蛋白有更近的进化关系。亚细胞定位实验说明OsIspE蛋白定位于水稻细胞的叶绿体上。利用野生型中OsIspE基因的全长CDS构建表达载体pCAMBIA2300-OsIspE,进行了转基因互补实验证。结果显示,转基因株系在幼苗期呈现出正常绿色表型,其光合色素含量已经恢复到野生型亲本的水平,表明野生型IspE基因互补了gry340突变体表型,说明该突变体表型是由OsIspE单碱基突变引起的。qRT-PCR定量分析显示,OsIspE基因属于组成型表达,在苗期的根和叶,以及孕穗期的根、茎、叶、叶鞘和幼穗中均有表达;其中在苗期,叶中的表达量较高;在孕穗期,叶中的表达量最高,其次是叶鞘,而在根中的相对表达量最低。野生型亲本的IspE基因表达随着生长发育显著增加,在9叶期达到峰值,在孕穗期只下降大约一半;同时,gry340突变体中ispE的表达量随着生长发育也显著增加,在9叶期和孕穗期与野生型无显著差异。利用gry340突变体与OsIspF基因突变体505ys进行杂交,获得F_2分离群体。在F_2中纯合的ispE ispF双突变体呈现黄化致死表型,说明来自细胞质MVA途径的类异戊二烯前体物质也不能有效补偿叶绿体中MEP途径的缺陷。为分析该双突变体与野生型亲本日本晴的基因表达差异,利用qRT-PCR检测了30个相关基因的表达,包括7个MEP途径基因、6个MVA途径基因、8个光合作用相关基因及9个线粒体基因组编码的电子传递复合体基因。结果显示,在21个MEP、MVA途径基因及光合作用相关基因中,仅psbA基因的表达量保持不变,ispE、HMGR1、HMGR2和psbP基因显著上调,其它16个基因的表达量显著下调。在9个线粒体基因组编码的电子传递复合体基因中,只有cox2和atp8基因的表达量显著下调,其它7个基因的表达量显著上调。同时,我们也检测了上述30个基因在gry340突变体中的表达情况,获得了与ispE ispF双突变体相似的结果,只有ispE、MPDC1、psbP、cox2和apt8等5个基因不同。结果表明,水稻MEP途径基因的功能缺陷影响了MEP途径中其它基因、MVA途径基因、光合作用基因以及线粒体基因的表达。暗示突变受损的叶绿体和线粒体的反馈调节信号可能会影响上述基因的表达。
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S511
【图文】：

途径,细胞质,醌类化合物,甾醇类

图 1-1 在植物细胞中类异戊二烯的两条合成途径ǐ（1）叶绿体中的 MEP 途径合成的 IPP 用于合成叶绿素ǎ类胡萝卜素和醌类化合物ǐ（2）细胞质中的 MVA 途径合成的 IPP 主要用于甾醇类和线粒体中泛醌类化合物的合成[9]ǐFig.1-1. Scheme showing the compartmentation of the two isoprenoid biosynthesis pathways in theplant cell:（1）the chloroplastic DOXP/MEP pathway for the biosynthesis of the active C5-units（IPP）for chlorophylls （phytyl side-chain）, carotenoids and prenylquinones （isoprenoid side-chains）, and（2） the cytosolic acetate/Mevalonate pathway of IPP biosynthesis for the formation of sterols and theprenyl side-chain of the mitochondrial ubiquinones.1.1.1 细胞质中 MVA 合成途径在上世纪中首先在动物和酵母中发现了 MVA 途径，主要存在于细胞质中，因此又称为细胞质途径（cytosolic pathway）[10]（图 1-1）ǐMVA 途径中萜类化合物首先是两分子的乙酰辅酶 A（CoA, acetyl coenzymeA）在乙酰辅酶 A 乙酰基转移酶（AACT，acetyl CoA acetyl-transferase）的催化下缩合为乙酰乙酰辅酶 A，再经 HMG-CoA 合成

叶期,突变体,分蘖期,苗期

日本晴与 gry340 突变体的表型ǐ（A）苗期；（B）6 叶期；（C）分蘖期otypes of the gry340 mutant and its wild-type parent Nipponbare. (A) Seedhe six-leaf stage. (C) Tillering stage. (D) Grain-filling stage.0.00.51.01.52.02.5 WT gry3400.20.40.6BD********0.00.71.42.12.83.50.20.40.60.8AC******Chlbcontent(mg/gFW)Chlcontent(mg/gFW)Carcontent(mg/gFW)Chlacontent(mg/gFW)gry34WTgry340

酶切鉴定,表型,苗期,野生型

得的阳性转基因植株在苗期呈现与野生型亲本一）ǐ我们选取在苗期表现一致的阳性植株进行光合株的总叶绿素ǎChl aǎChl b 和类胡萝卜素的含在灌浆结实期转基因阳性植物表型与野生型的表生型中的 OsIspE（LOC_Os01g58790）基因能够恢明了该突变体的表型是由于 OsIspE 基因序列在

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