筛选标记对重组CHO细胞转基因表达的影响及分子机制

发布时间：2020-07-29 11:33

【摘要】：背景由于哺乳动物细胞表达系统具备复杂的翻译后修饰功能,因而广泛应用于重组药物蛋白的生产。其中70%以上的重组药物蛋白由中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO)表达系统生产。有许多因素影响重组药物蛋白在CHO细胞中表达,表达载体是其中影响重组蛋白表达水平和质量的重要因素之一。当外源基因转入CHO细胞,转基因会发生随机整合,导致基因沉默及表达水平不稳定,极大地影响了重组蛋白在CHO细胞中的表达。因此对载体的优化已成为国内外研究的重点方向之一。目的分析弱化筛选标记、不同顺式作用元件结合筛选标记对CHO细胞转基因表达水平的影响及其分子机制。方法(1)将G418筛选标记基因突变(G418 mutation,G418mut),与CMV和SV40两种不同的启动子结合构建表达载体。脂质体转染CHO细胞48h后,采用倒置荧光显微镜观察增强绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,eGFP)荧光表达情况。G418筛选获得稳定细胞池,流式细胞术检测eGFP的表达。(2)克隆土拨鼠转录后调控元件(Woodchuck hepatitis post-transcriptional regulatory element,WPRE)到含有CMV启动子的表达载体,转染CHO细胞,观察荧光表达情况,流式检测eGFP表达。分析转基因拷贝数以及mRNA表达水平。稳定培养两个月检测其稳定表达水平。(3)选择四种常见的哺乳动物细胞筛选标记,杀稻瘟菌素、博来霉素、嘌呤霉素及潮霉素,进行CHO细胞药物敏感实验;选择周期较短的药物抗性基因替换原载体中的G418抗性基因构建新的载体,转染细胞,流式分析eGFP表达水平。(4)将载体中的eGFP报告基因克隆到G418抗性基因的上游,并在CMV启动子的下游克隆促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO),构建含EPO及eGFP-G418嵌合基因的载体。转染CHO细胞;筛选稳定细胞池;挑11株单克隆,荧光倒置显微镜下观察其绿色荧光并标记荧光信号强弱程度;流式细胞术分别检测11株克隆的eGFP表达水平,分为高中低三组标记,并与其分别对应的荧光信号强度进行比较;Western blot检测其中高中低细胞株的EPO表达水平;分析其蛋白表达水平是否与eGFP表达水平相关。结果(1)利用弱化的G418抗性基因成功构建了两个含不同启动子(CMV和SV40)的载体。转染48h后的瞬时表达结果显示G418弱化基因在两种不同启动子均可提高eGFP表达。稳定表达结果分析表明,和对照相比,CMV+G418mut和SV40+G418mut均能提高转基因的表达。CMV启动子介导下,eGFP表达水平的提高尤为显著,提高了2.62倍(P0.05)。(2)将CMV启动子介导下的载体插入WPRE基因片段后,CMV+G418mut+WPRE的转基因表达水平相比CMV+G418有所下降。CMV+G418+WPRE的eGFP表达水平在所有载体中最高,提高3.02倍(P0.05)。拷贝数分析结果显示:和对照相比,CMV+G418mut的拷贝数高达10.76倍。mRNA表达水平分析也显示CMV+G418mut的mRNA表达水平最高,为对照的9.61倍。稳定培养两个月后,流式结果显示,含有G418mut的载体转基因表达量下降最为明显,而含有WPRE的载体表达水平相对稳定,仍呈现较高的表达水平。(3)在筛选标记选择实验中杀稻瘟菌素(4-5d)和潮霉素B(10-12d)体现了较强的优势,能在较短时间内将未转染的CHO细胞胞全部杀死。构建载体转染细胞,48h后荧光表达结果显示含有杀稻瘟菌素抗性基因的载体被成功转入细胞,其转染效率低于G418抗性基因,但是稳定结果显示其eGFP表达水平高于G418抗性基因。(4)由EPO-EGFP-G418嵌合基因载体筛选出的11株单克隆根据荧光强弱分为三组,与其分别对应的eGFP表达结果相比较。结果显示,荧光信号强度强的单克隆细胞株所对应的eGFP表达水平也较高,成正相关。Western Blot结果分析得到eGFP表达水平较高的克隆株其EPO蛋白产量也相对较高。结论(1)G418突变能够在不同启动子的介导下提高转基因在CHO细胞里的表达水平。(2)WPRE顺式作用表达元件能有效提高载体在CHO细胞中转基因表达水平。其中CMV+G418+WPRE组合提高转基因表达水平的效果最为显著。(3)在四种筛选标记中,杀稻瘟菌素具有明显的优势。(4)利用eGFP嵌合筛选标记能够预测重组蛋白的表达水平。
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78
【图文】：

基因序列,启动子,抗性基因,稀释液

(16)一抗稀释液配置：4μl 一抗+4MLTBST二抗稀释液配置：4μl 二抗+4MLTBST1.2 方法1.2.1 载体构建1.2.1.1 含 SV40 启动子的 pIRES-EGFP 载体的构建通过亚克隆使 SV40 启动子（GenBank：LT727396.1）替换 CMV 启动子得到 SV40启动子启动的载体，即 SV40+G418。设计的 SV40 基因如附录补充图 1 所示。1.2.1.2 弱化载体构建（1）突变 G418 抗性基因合成根据前期文献报道[17,18]，实验设计将新霉素磷酸转移酶 cDNA 产物通过聚合酶链式反应（PCR）- 依赖性诱变将 261 处的氨基酸 D 突变为氨基酸 G，并且克隆到上述载体中。设计突变 G418 抗性基因如图 1 所示，由安徽通用生物工程有限公司合成。

抗性基因,杀稻瘟菌素,筛选标记,潮霉素

A 为 pIRES-EGFP 出发载体。B 为 CMV 和 SV40 启动子、G418 抗E 构建的新载体。 Vector construction map. A :pIRES-EGFP vector; B :The new vectors with CMoters , G418 resistance genes and WPRE element..2 不同筛选标记抗性基因载体的构建将 pIRES-EGFP 中的 G418 分别替换为杀稻瘟菌素抗性基因（GenBan7245.1）、潮霉素 B 抗性基因（GenBank : JN596098.1），构建两个新由安徽通用生物有限公司合成，如附录补充图 4，图 5 所示。

杀稻瘟菌素,抗性基因,序列,筛选标记

A 为 pIRES-EGFP 出发载体。B 为 CMV 和 SV40 启动子、G418 抗性构建的新载体。 Vector construction map. A :pIRES-EGFP vector; B :The new vectors with CMVters , G418 resistance genes and WPRE element.2 不同筛选标记抗性基因载体的构建将 pIRES-EGFP 中的 G418 分别替换为杀稻瘟菌素抗性基因（GenBank7245.1）、潮霉素 B 抗性基因（GenBank : JN596098.1），构建两个新载由安徽通用生物有限公司合成，如附录补充图 4，图 5 所示。

【参考文献】