表达REV env基因的重组马立克病毒的构建及生物学活性研究

发布时间：2020-08-02 17:50

【摘要】：禽网状内皮组织增生病(Reticuloendotheliosis,RE)、马立克病(Marek's disease,MD)是危害我国养禽业健康发展的两大重要免疫抑制性疫病。前期对我省乃至全国范围内鸡群RE的检测,表明RE在鸡群的流行越来越普遍,然而,目前尚没有有效的疫苗对RE进行防控。苏帅等构建了马立克病毒(Marek's disease virus,MDV)致肿瘤基因meq的缺失疫苗SC9-1,能够为免疫鸡提供100%的免疫保护,显著高于MD商品化疫苗CVI988/Rispens的免疫保护(保护率80-90%)。本研究利用SC9-1构建了表达禽网状内皮增生病病毒(Reticuloendotheliosi s virus,REV)env基因的重组MDV,并对其生物学活性进行了研究。1、构建表达REV env的重组MDV SC9-env,并对其致病性、免疫保护效果进行了研究以REV SNV株DNA为模板,PCR扩增其env基因,克隆进真核表达载体pcDNA3.1(+);以其为模板,PCR扩增整个REV env基因真核表达盒与卡那霉素抗性基因分别克隆进pUC18载体;pUC18-env-kana为模板,利用含有MDV SC9-1株meq基因位点两侧同源臂的引物经PCR扩增REV env真核表达盒以及卡那霉素抗性基因,利用同源重组插入SC9-1的meq位点,分别筛选出阳性后,最终利用阿拉伯糖诱导表达flp重组酶,敲除卡那霉素抗性基因,阳性重组质粒命名为SC9-env BAC。选阳性重组质粒SC9-env BAC,转染CEF细胞,拯救重组MDV,利用MDV单抗H19以及REV单抗11B118经间接免疫荧光试验鉴定阳性,命名为SC9-env,分析在CEF细胞上的复制水平,利用动物实验评价SC9-env对SPF鸡的致病性以及SC9-env对SPF鸡感染MDV、REV的免疫保护效果。SC9-env接种SPF鸡没有引起死亡以及肿瘤的发生;SC9-env对感染MDV rMd5的SPF鸡能够提供92%的免疫保护,与SC9-1差异不显著;SC9-env能够降低SNV感染SPF鸡引起的体重减轻以及灭活苗抗体水平的下降。2、利用同源重组技术构建了表达REV env、gp90的不同重组MDV以REV SNV株DNA为模板,PCR扩增其env基因、gp90基因,克隆进真核表达载体pCAGGS;以其为模板,PCR扩增整个REV env基因真核表达盒、REV gp90基因真核表达盒并与卡那霉素抗性基因分别克隆进pUC18载体。以pUC18-env-kana为模板,利用含有MDV SC9-1株US10基因位点两侧同源臂的引物经PCR扩增REV env真核表达盒以及卡那霉素抗性基因;以pUC18-gp90-kana为模板,利用含有MDV SC9-1株US10基因位点两侧同源臂的引物经PCR扩增REV gp90真核表达盒以及卡那霉素抗性基因,利用同源重组插入SC9-1的US10位点;以pUC18-gp90-kana为模板,利用含有MDV SC9-1株meq基因位点两侧同源臂的引物经PCR扩增REV gp90真核表达盒以及卡那霉素抗性基因,利用同源重组插入SC9-1的meq位点。分别筛选出阳性后,最终利用阿拉伯糖诱导表达flp重组酶,敲除卡那霉素抗性基因,阳性重组质粒命名为SC9-gp90-2 BAC、SC9-env-3 BAC、SC9-gp90-4 BAC;分别提取SC9-gp90-2 BAC、SC9-env-3 BAC、SC9-gp90-4 BAC质粒,转染CEF细胞,拯救三种种重组MDV,利用MDV单抗H19以及REV单抗11B118经间接免疫荧光试验鉴定阳性,命名为SC9-gp90-2、SC9-env-3、SC9-gp90-4。本研究为进一步构建表达REV env基因的重组MDV并评价其免疫保护效果奠定基础。结果表明,利用同源重组技术构建的重组MDV SC9-env、SC9-env-3能够稳定表达REV env蛋白,SC9-gp90-2、SC9-gp90-4能够稳定表达REV gp90蛋白。重组MDV SC9-env在CEF细胞上的复制水平与亲本病毒SC9-1相似。3、不同启动子的真核重组质粒pcDNA-env、pCAGGS-env、gB-env在CEF细胞上REV env表达效果的比较比较带有不同启动子的重组质粒pcDNA-env、pCAGGS-env、gB-env在细胞上表达效果。结果表明β-actin启动子活性强于cmv启动子,而且cmv启动子活性强于gB启动子活性。重组gp90蛋白免疫鸡可诱导鸡产生特异性抗体,未发现不良反应,说明重组亚单位疫苗对雏鸡和种鸡是安全可靠的。结果表明,gp90蛋白具有良好的抗原性,RE亚单位疫苗可以诱导高水平的抗体反应,对雏鸡和种鸡均具有良好的免疫效力。本研究构建能够表达禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)env基因或gp90基因的重组MDV并对其生物学活性进行研究。本研究以前期构建的血清I型MDV meq基因缺失株SC9-1为载体,利用同源重组技术将REV env、gp90基因插入SC9-1的基因组,构建重组MDV,SC9-1为载体能够稳定表达外源基因,构建的重组MDV SC9-env对SPF鸡没有致病性,本研究对SPF鸡感染MDV、REV均具有一定的免疫保护效果为其它重组MDV的构建提供思路,也为REV的免疫防控奠定基础。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65
【图文】：

结构图,全基因组,I型,结构图

2014），而对于REV的防控还没有更好的方法。另一方面疫苗。随着MDV毒力的不断增强，国内外学者正在研究比CVI98疫效果的疫苗（周煜，2014）。同时利用MDV作为载体的优势，良好免疫效果的MDV重组活载体疫苗。立自主知识产权的马立克基因缺失疫苗，Lee等首次绘制了I型MDV GA株的全基因组图谱(图1)，为今后提供了参考依据。通过比较超强毒Md5与GA株基因组，发现I型MGA的基因组稍微小于Md5，主要是由于Md5基因组的TRL和IRL区贝数的增加以及IRS和TRS区域长度的增加。I型MDV的基因组中因，meq基因由339个氨基酸组成，在其N末端含有一个与jun/fos亮氨酸拉链(bZIP)结构域，而在C末端富含与WT-1肿瘤抑制基因相域。大量的试验证实MDV基因组中的meq基因与其致瘤作用密切。

电泳图,电泳图,真核表达载体,回收利用

3.1 表达REV env的重组MDV病毒的构建、拯救、鉴定及生物活性比较3.1.1 env的扩增与回收利用Env-F/R引物PCR扩增1782bp的env基因（图2），经过常规克隆后测序，测序结果与预期结果一致，可以用来与真核表达载体连接。图2目的基因env PCR扩增电泳图Fig.2 Target gene env PCR amplification electrophoresisM：DL2000 DNA Mark; 1-3：env基因PCR扩增产物M: DL2000 DNA Mark; 1-3: env gene PCR amplification electrophoresis3.1.2 将env基因、gp90基因与真核表达载体连接及鉴定上一步验证后的env基因pcDNA3.1载体同时用限制性内切酶HindIII、XbaI酶切后，跑胶验证回收后，用DNA Ligase进行连接，转化进感受态细胞DH5α后，提取质粒，重组质粒pcDNA-env（图3）转染CEF细胞，以REV单抗11B118进行IFA鉴定

电泳图,真核表达重组质粒

图2目的基因env PCR扩增电泳图Fig.2 Target gene env PCR amplification electrophoresisM：DL2000 DNA Mark; 1-3：env基因PCR扩增产物M: DL2000 DNA Mark; 1-3: env gene PCR amplification electrophoresis3.1.2 将env基因、gp90基因与真核表达载体连接及鉴定上一步验证后的env基因pcDNA3.1载体同时用限制性内切酶HindIII、XbaI酶切后跑胶验证回收后，用DNA Ligase进行连接，转化进感受态细胞DH5α后，提取质粒，组质粒pcDNA-env（图3）转染CEF细胞，以REV单抗11B118进行IFA鉴定，分别发亮绿色荧光。

【参考文献】