核盘菌Ss-FoxE2基因互作蛋白的筛选及Ss-Chk2基因功能分析

发布时间：2020-08-02 15:33

【摘要】：核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)是一种非常重要的植物病原真菌。其寄主广泛,可以侵染500多种植物,引起菌核病,造成大量的经济损失。目前主要依靠化学药剂防治,但是存在污染环境、抗性增强等问题。从分子层面研究核盘菌的致病与生长发育可以给我们提供新的思路防治核盘菌。研究表明,在核盘菌生活史及侵染循环中,菌核与子囊盘发挥重要作用。菌核可以躲过逆境,第二年产生菌丝造成初侵染。子囊盘所产生的子囊孢子再次侵染周边的植物,造成病害的流行。前期的研究发现核盘菌中一类具有Forkhead结构域的转录因子与菌核及子囊盘的发育有关。其中一个Forkhead蛋白Ss-FoxE2的缺失,会使菌核不能萌发形成子囊盘。本研究主要利用酵母单杂交技术筛选与Ss-FoxE2基因互作的蛋白,解析上游调控子囊盘发育的途径。同时在核盘菌基因组中发现一个蛋白Ss-Chk2,该蛋白具有FHA(Forkhead-associated domain)与丝氨酸/苏氨酸激酶结构域,并预测到其与核盘菌的生长发育有关。本研究也同时对其功能进行了分析。通过酵母单杂交的方法从核盘菌c DNA文库中筛选出7个与Ss-FoxE2基因互作的蛋白,编号SsE2-1~7。构建蛋白完整的cDNA序列到pGADT7载体,与诱饵载体共转化酵母初步验证了SsE2-7为假阳性。通过原核表达,成功表达了除了SsE2-5之外的其他6个蛋白,且除了SsE2-2外均为可溶性蛋白。用Ni-NTA Agarose纯化出了部分蛋白,EMSA实验证明,以pCold TF为骨架的载体表达的SsE2-1-2、SsE2-1-3蛋白与探针2、3均发生了结合,但不能排除TF蛋白的干扰。采用同源重组的方法,敲除了Ss-Chk2基因。表型分析发现该基因对侵染结构及致病性影响不大,敲除后菌丝生长变快,说明该基因在调节菌丝生长方面有一定的作用。对于不同胁迫条件的,反应不同。突变体对于1 M KCl,1 M NaCl,0.02%SDS更敏感,菌丝比野生型长的慢。1 M山梨醇处理下突变体与野生型差异不显著。突变体对不同浓度的H_2O_2更敏感,突变体在15 m M H_2O_2平板上突变体不能生长,而野生型可以生长。表明该基因在核盘菌适应逆境胁迫中有作用。以上研究结果,为进一步研究Ss-FoxE2调控子囊盘发育途径及Ss-Chk2调控生长发育等奠定了基础。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S432.44

【参考文献】

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本文编号：2778713