胸腺素β4基因调节内皮细胞功能及其干预心肌损伤的研究

发布时间：2020-08-03 08:28

【摘要】：第二部分 胸腺素β4基因修饰内皮细胞的体外研究目的:利用腺病毒载体转染技术研究Tβ4基因修饰内皮细胞的作用。方法:本研究成功将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)进行培养,将Tβ4腺病毒转染细胞,采用不同方法观察细胞功能。采用常氧和缺氧条件测试细胞凋亡,MTT法检测细胞增殖;Transwell法测定细胞迁移;Western Blotting法检测信号通路蛋白表达。结果:在常氧和缺氧条件下Ad-T β 4组细胞凋亡都减少,尤其Ad-Tβ4缺氧组细胞凋亡率比Ad-NC缺氧组减少更加明显(12.35%VS 21.24%,p0.05),这种作用能够被Ly294002阻断(20.94%);MTT法Ad-T β 4组和对照组和Ad-NC组比较,细胞72小时后增殖率明显增加(0%VS 3.23%VS 60.04%,P0.05);Transwell法常氧条件下Ad-T β 4组细胞计数(54.56±3.09)比Ad-NC组(42.11±2.71)和Ad-T β 4+Ly组(14.89±2.80)明显增多,p:0.01;Western Blotting法在常氧条件下Ad-T β 4组Caspase3相对表达没有太大变化,而在缺氧条件下Ad-T β 4组Caspase3相对表达较其他组明显减少。在常氧条件下Ad-T β 4组p-Akt相对表达增加,缺氧条件下Ad-T β 4组p-Akt相对表达也比其他组增加,PI3K抑制剂Ly294002显著降低了其表达。结论:腺病毒携带T β 4基因可以有效转染内皮细胞,修饰后的内皮细胞更具有生存活力和治疗应用价值。在缺氧条件下,Tβ4可以提高PI3K表达和酶解活性增加其下游因子Akt的活化。第三部分 携带Tβ 4基因腺病毒治疗家猪急性心肌梗死的作用研究目的:通过动物实验研究观察携带T 4基因腺病毒对于急性心肌梗死后缺血损伤的影响。方法:成功建立了 12例家猪急性心肌梗死动物模型,分为三组,Ad-T β 4组、Ad-NC组、对照组,分别经冠状动脉注射Tβ 4腺病毒、NC腺病毒、生理盐水。造模成功后第2天、第30天,经3.0T磁共振检查心脏功能和梗死面积;梗死部位心肌组织做成组织匀浆,离心后ELISA方法测定T β 4含量。统计学分析比较。结果:造模成功后第2天三组的梗死面积占比、EF值都没有显著差异。第30天,梗死面积占比(%)在Ad-Tβ4 4组(22.6±3.2)比Ad-NC组(28.0±2.7)和对照组(27.1±1.5)明显减少,差异有统计学意义(p0.05);EF值(%)在Ad-Tβ 4组(48.75±3.77)比另两组增高,与对照组(41.25±2.99)比较差异有统计学意义(p0.05)。Tβ4含量在Ad-Tβ 4组(9.039±2.531ng/ml)明显比对照组(2.139±0.953ng/ml)和Ad-NC组(2.071±0.797ng/ml)增高,差异有统计学意义(p0.05)。结论:Tβ 4基因腺病毒对急性心肌梗死后的缺血损伤产生有利的影响,并改善了心功能。第四部分 脾功能亢进对心力衰竭患者胸腺素β 4水平的影响目的:观察脾功能亢进合并心力衰竭患者中氧化应激产物和胸腺素β4的水平及内皮细胞功能的变化,揭示脾功能亢进恶化心力衰竭的机制。方法:慢性心力衰竭NYHA心功能分级III或IV级的患者,合并脾功能亢进者33例,不合并脾功能亢进者35例。MACS法分离EPCs,PCR定量,TUNEL分析评估细胞凋亡。ELISA方法检测VCAM-1、ICAM-1、P选择素、E选择素、游离血浆血红蛋白、Tβ 4血清浓度,绿高铁血红蛋白检测游离亚铁血红素血清浓度。结果:游离血浆血红蛋白(pg/ml)和亚铁血红素(pg/ul)在CHF合并脾功能亢进患者中比对照组明显增加(307.75土130.49 vs.212.46±121.11,P0.001;and 1.96±0.82 vs.1.26±0.77,P0.001,respectively)VCAM-1、ICAM-1、P选择素和E选择素表达水平在CHF合并脾功能亢进患者中比对照组更高(p0.001)。24个月后与对照组比较,CHF合并脾功能亢进LVEF明显降低(41.06%±7.77%vs.47.05%±10.62%,P=0.01),游离血浆血红蛋白和亚铁血红素水平和LVEF有明显对应关系(r=-0.29,P=0.015;and r=-0.28,P=0.020,respectively)。CHF合并脾功能亢进患者的EPCs显示有明,显的增值能力下降(p0.001),缺血刺激6小时后发现TUNEL+ EPCs(%)比对照组显著增加(36.5±11.8 vs.21.2±7.4,P0.001)。胸腺素β4水平在CHF合并脾功能亢进组比对照组明显降低(5.80±3..85 ng/ml vs.8.3.4±4.06 ng/ml,p0.05),通过直线回归,我们发现LVEF作为因变量与胸腺素β4水平呈明显的正直线相关,R=0.331,P=0.006。结论:脾功能亢进通过激活氧化应激反应和内皮功能障碍恶化了心功能,胸腺素β4在脾功能亢进中减少,并和心功能衰竭程度相关。第一部分携带胸腺素β4基因序列腺病毒载体制备目的:本研究利用全基因合成的质粒构建腺病毒表达载体,并进行腺病毒的包装和滴度测定。方法:本实验采用的是AdMax系统的真核腺病毒包装体系。先对目的基因序列进行分析检查,然后根据基因序列分析结果,进行设计合成、酶切、拼接,将合成好的序列装入pMD-18T载体并转化至感受态细胞DH5α,测序并扩增片段,制成含有目的序列的GFP共表达质粒,设计PCR扩增引物扩增后使用Invitrogen公司的重组系统将上述目的片段重组到载体pAD/CMV/V5-DEST上。构建的腺病毒表达载体经Pac I消化后转染293A细胞,包装病毒。在病毒滴度检测方面,本实验采用了免疫法来检测腺病毒的滴度。结果:腺病毒载体重组质粒成功制作。确定腺病毒的滴度为2.12×1010ifu/ml。结论:可以通过全基因合成的途径成功制备携带Tβ4基因序列的腺病毒载体。
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R54
【图文】：

带有酶切位点的基因全长电泳照片

pIRES-EGFP载体酶切电泳照片

图 3 带 attB1 和 attB2 位点的目的基因2. 测序结果参见“附件：基因测序”：E06_CS100513001_0073.373-1.M13R(D03_CS100525525_5225.Z7730-1.PIRB07_CS100607542_5184.373LR-5.PEGD06_CS100603512_5082.373LR-5.V5RD07_CS100603512_5081.373LR-5.CM阶段 2：腺病毒的

【参考文献】

相关期刊论文 前6条

1 林艾雯;陈竹君;;动脉粥样硬化与内皮细胞损伤机制的研究进展[J];岭南心血管病杂志;2015年04期

2 黄修献;李利华;吴新华;;血管内皮细胞与动脉粥样硬化[J];医学综述;2010年18期

3 孟志华;丁彦青;全显跃;徐新;唐良秋;马绍椿;潘高升;卢雨零;陈振松;雷淑妃;杨昂;;磁共振心肌灌注成像评价心肌梗死PTCA治疗前后心肌存活[J];南方医科大学学报;2009年03期

4 张夏华;吴广通;李蓉;;基因治疗现状与前景[J];药学实践杂志;2009年01期

5 赵凯;杨万松;;关于氧化应激致动脉粥样硬化的研究进展[J];中国心血管杂志;2006年02期

6 肖英华,李雅轩,郑继刚;病毒——基因治疗中有效的载体系统[J];生物学通报;2003年11期

本文编号：2779369