葡萄风信子花色形成关键基因DFR原核表达及功能验证

发布时间：2020-08-04 21:38

【摘要】：本研究根据课题组前期从葡萄风信子‘亚美尼亚’中克隆到的MaDFR2b序列,构建原核表达载体pET-28a(+)-MaDFR2b、pMAL-c5x-MaDFR2b,在不同诱导温度、IPTG浓度、诱导时间条件下诱导融合蛋白表达,用SDS-PAGE检测重组融合蛋白MaDFR2b的表达情况,选出可溶融合蛋白的最优诱导条件。获得的可溶重组融合蛋白经亲和层析法纯化后,进行体外酶促反应鉴定其活性。取得结果如下:1.用原核表达的方法体外诱导葡萄风信子MaDFR2b蛋白表达,结果表明在大肠杆菌表达系统中,28℃、IPTG浓度0.5mM,诱导6小时时能高效诱导出可溶性的MaDFR2b融合蛋白。采用亲和层析法对目的蛋白进行纯化,经SDS-PAGE检测和Quantity-one分析可知,其纯度达90%,纯化的MaDFR2b融合蛋白达到了符合后续实验要求的纯度。2.获得的目的蛋白以二氢黄酮醇为底物进行体外酶促反应实验,高效液相色谱结果显示,葡萄风信子MaDFR2b能催化二氢槲皮素和二氢杨梅素,但是不能催化二氢山奈酚。3.农杆菌介导的瞬时转化实验:构建MaDFR2b过量表达载体,通过农杆菌注射法瞬时转化月季‘苏醒’,结果显示,携带功能基因的过表达载体侵染的月季花瓣出现蓝色斑块。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S682.29
【图文】：

酶促反应体系如下（李厚华）：100mM Tris-HCL (PH=7.5) 370μl,10μl,10μg/μl 二氢黄酮醇 10μl,纯化蛋白 20μg,用 ddH2O 补齐至 500育 4h 后，反应物用 500 uL 乙酸乙酯终止反应，于 50℃烘箱烘干，用萃取液：甲酸：三氟乙酸=2:7:2:1）萃取 2 次(Zhang et al., 2012; 韩振云 et al.心后上清用 0.22μm 微孔滤膜过滤，并通过 HPLC 检测酶促反应产物。高效液相色谱反应条件为：流速 0.8ml/min，流动相 A 相为 0.1%甲酸，B腈。洗脱程序为：0min，12%B；15min，25%B；32min，38%B；40min5min，12%B；50min，12%B。紫外检测吸收波长为 530nm 和 340nm（王琳 等.3 结果与分析.3.1 原核表达载体 pET-28a（+）-MaDFR2b、pMAL-c5x-MaDFR2b 的构建以获得的 pMD 19-T-MaDFR2b 质粒为模板，通过 PCR 扩增获得了与目一致的 MaDFR2b 片段（约 1100bp）（图 2-1）。将 MaDFR2b 和载体双酶切到 pET-28a（+）和 pMAL-c5x 原核表达载体上，得到重组质粒（图 2-2）。测序，经 Blast 序列比对，测序结果与 MaDFR2b 基因序列一致。

原核表达载体pET-28a(+)示意图

图 2-2 原核表达载体 pET-28a(+)示意图Schematic of Prokaryotic Expression Vector pET-28a(+)

【参考文献】

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本文编号：2781113