miR-103-3p对心肌细胞ERG基因表达影响的相关研究

发布时间：2020-08-06 10:07

【摘要】：背景与目的:心源性猝死(Sudden Cardiac Death,SCD)严重危害全人类的健康,我国每年有54.4万人死于SCD。90%SCD与室颤等恶性心律失常有关。人类果蝇相关基因(Human ether-a-go-go-related gene;hERG)编码快速激活延迟整流钾通道(rapidly activated delayed rectifier potassium currents,Ikr)的α亚基在动作电位3期有着重要作用,其编码功能异常导致QT间期延长,从而引发心律失常。大量科研数据证实mi RNA与心律失常的病理生理具有一定的关联。本研究组前期利用生物信息学比对筛选出与hERG相关的miRNA,应用双荧光素酶基因报告法验证筛选出的miRNA。研究发现has-miR-103a-1与hERG基因表达具有相关。本研究组前期在转染hERG的HEK-293细胞中通过Western Blot、实时荧光定量PCR、激光共聚焦、膜片钳发现miR-103a-1可下调hERG基因表达。HEK-293由于极少表达胞外配体的受体且易于转染,常用于外源基因的研究。但其不能模拟人心室肌细胞,且人心室肌细胞不易获得,故在动物心肌细胞H9C2和乳鼠原代心室肌细胞上验证miR-103-3p对ERG基因的调控机制。材料与方法:培养H9c2(2-1)细胞和SD大鼠乳鼠原代心室肌细胞。通过Lipofectamine 2000,将pcDNA3-hERG基因转染至H9C2心肌细胞,间隔24小时后再将rno-miR-103-3p agomir、rno-miR-103-3p agomir nc、rno-miR-103-3p antagomir、rnomiR-103-3p antagomirnc转染H9C2心肌细胞。转染48小时后,通过采用RT-qPCR、Western Blot、细胞化学免疫荧光技术检测miR-103-3p和反义寡聚核苷酸对ERG基因表达m RNA和蛋白水平的影响。将包装反义寡聚核苷酸AMO-103-3pNC和AMO-103-3p的慢病毒转染乳鼠原代心室肌细胞,转染96h后通过采用Western Blot技术检测反义寡聚核苷酸AMO-103-3p NC对ERG基因表达蛋白水平的影响。结果:rno-mi R-103-3p agomir nc和rno-miR-103-3p agomir转染H9C2细胞后:(1)RT-qPCR检测ERG基因m RNA水平,实验结果显示无明显差异;(2)Western blot检测ERG基因的蛋白表达量减少;(3)经细胞化学免疫荧光技术发现H9C2细胞胞质和胞膜荧光亮度下降;rno-miR-103-3p antagomirnc和rno-miR-103-3p antagomir转染H9C2细胞后:(1)RT-qPCR检测ERG基因mRNA水平,实验结果显示无明显差异;(2)Western blot检测ERG的蛋白水平量增加;(3)利用细胞化学免疫荧光技术,H9C2细胞胞质和胞膜荧光增强。AMO-103-3p转染乳鼠心肌细胞后:ERG蛋白水平下降。结论:研究结果表明rno-miR-103-3p下调ERG基因的蛋白水平的表达,AMO-103-3P通过沉默rno-miR-103-3p而使ERG蛋白水平提高。
【学位授予单位】：宁波大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R541.78

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