紫杉醇生物合成相关P450羟化酶基因的挖掘及功能研究

发布时间：2020-08-07 02:43

【摘要】：紫杉醇是临床上广泛使用的抗癌药物,主要从红豆杉植物中提取获得,但天然提取得到的紫杉醇远不能满足临床需求,寻求新的紫杉醇药源途径迫在眉睫,发展合成生物学技术是解决紫杉醇供需矛盾的重要途径。目前,紫杉醇生源路径中大部分酶的基因已被确认,但尚有母核上较多细胞色素P450羟化酶基因及其功能未被确认,尤其是母核上C1、C4和C9位对应的细胞色素P450羟化酶基因尚未发现,这是目前研究紫杉醇合成生物学技术的热点和难点。本课题基于中国红豆杉转录组数据,对红豆杉CYP450基因进行系统鉴定,通过功能注释及表达差异分析,挖掘紫杉醇生物合成相关的新的羟化酶候选基因,并通过基因克隆及功能研究进行候选基因的确认。取得的主要研究结果如下:1)中国红豆杉CYP450基因的系统鉴定基于中国红豆杉转录组数据,发现了118个全长和175个非全长的中国红豆杉CYP450基因。其中,除了5个基因(TcCYP725A1,TcCYP725A2,TcCYP725A4,TcCYP725A5,TcCYP725A6)被报道,以及另一个TcCYP725A3与已知的东北红豆杉的CYP725A3同源性达99%外,绝大多数CYP450基因都由本文首次发现。获得的118个中国红豆杉全长CYP450经国际标准化分类和命名,被分为8个聚类(clan)和29个家族,同时被分为两个类别:A-type和non-A-type。其中,52个基因(44.1%)属于A-type(71 clan),归属于11个家族,剩下的66个基因(55.9%)为non-A-type,分属于18个家族和7个clan。其中,在non-A-type中还发现两个新的CYP450家族,即CYP864和CYP947。进化分析表明,中国红豆杉CYP450的遗传组成与裸子植物云杉较为一致,而与被子植物拟南芥、苜蓿等有较大差异。中国红豆杉CYP450s虽然高度分化成多个家族,但仍然有着结构上的保守特征,包括PFG element,PERF motif,K-helix region和I-helix region。2)紫杉醇生物合成相关CYP450羟化酶候选基因的筛选对鉴定到的118个全长中国红豆杉CYP450序列进行了功能注释。在Blast2Go中,这些CYP450s被划分为三大类:细胞组分(cellular component)、生物过程(biological process)与分子功能(molecular function),又具体分为21个功能组。将这118个CYP450s序列提交至Swissport,Nt,Nr,COG,GO,KEGG数据库中,使用BLASTX程序进行比对,阈值设为E1e~(-5)。结果表明,绝大多数CYP450s都得到了注释,其中有15个新的CYP725家族基因(从CYP725A9至CYP725A23)被注释到与紫杉醇生物合成相关。对中国红豆杉CYP450s的表达差异分析发现,注释得到的15个新的CYP725家族基因中,TcCYP725A9,TcCYP725A11,TcCYP725A16,TcCYP725A20,TcCYP725A22和TcCYP725A23这6个基因的表达规律与已知紫杉醇合成羟化酶基因的表达规律一致且与紫杉醇合成量呈正相关,是最可能的与紫杉醇生物合成相关的候选羟化酶基因。3)中国红豆杉TcCYP725A22和TcCYP725A23的克隆与酵母异源表达功能研究选取两个候选羟化酶基因TcCYP725A22和TcCYP725A23进行克隆,同时克隆了已知的紫杉烷C2位羟化酶基因T2αH作为阳性对照。选用高拷贝、诱导型酿酒酵母表达载体pESC-TRP将这三个基因分别在WAT11中异源表达,Western blot结果表明,这几个目的蛋白均成功表达。为了鉴定出紫杉醇母核上未知的羟化酶,以具有多个潜在羟化位点的紫杉素作为底物,与C2位羟化酶T2αH、候选羟化酶TcCYP725A22和TcCYP725A23分别进行反应。反应产物的HPLC检测结果表明,T2αH可以对紫杉素进行转化,结果与文献报道一致。候选羟化酶TcCYP725A22对底物紫杉素表现出催化活性,依据质谱结果及反应底物紫杉素的分子结构,判断催化产物很有可能为添加了两个羟基的紫杉烷新衍生物,而TcCYP725A23对紫杉素未见有明显的催化活性。4)TcCYP725A22在中国红豆杉细胞体内的功能研究鉴于体外反应进行羟化酶功能探究体系中的紫杉烷底物难以获得,将具有潜在羟化功能的候选基因TcCYP725A22在中国红豆杉细胞中进行过表达,分析转基因细胞中紫杉烷类代谢物指纹图谱的变化情况,确定候选羟化酶基因的催化位点。结果发现,当TcCYP725A22基因过表达时,几个已知的紫杉醇合成相关的酶基因表达量也都有不同程度的上调;且细胞中各紫杉烷的含量普遍提高,其中H3T;decinnamoyl taxinine J;TC和TPT这4种物质的含量变化最为显著。综合分析这些物质的结构特点及酵母异源表达体外反应结果,可以判断TcCYP725A22最可能是一个新的C2位羟化酶基因。以上研究为进一步确定紫杉醇生物合成路径中的未知羟化酶奠定了基础,有助于完全解析紫杉醇生源途径,促进紫杉醇合成生物学技术的全面创立。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S791.49
【图文】：

血红素,三维结构,构象,细胞色素

450 这个名词来描述这类有色物质[3, 4]。事实上有催化功能的血红蛋白酶，该类蛋白中所含的形成血红素（heme），使得蛋白呈现红色。国际胞色素”来命名，但是“细胞色素 P450”这一俗导致很多不便之处[5, 6]。蛋白的催化功能具有底物选择性，属于一类 b 型铁-原卟啉Ⅸ）[7]。在 CYP450 蛋白的空间结构其中的铁原子可以以氧化型（Fe3+）和还原型YP450 参与电子的传递过程。当原叶琳铁以 Fe吸收峰在 416 nm 处，在还原型（Fe2+）细胞色素 416 nm 处的峰将消失，而在 450 nm 处出现一白变性失活时，CO 差光谱得到的最大吸收峰不 CYP450 就变为 CYP420。

机制,分子氧,还原酶,还原反应

还原反应0 的催化循环中，第一个电子的传递是非常快速的[15]。电和 FMN 的还原酶，再传递到 CYP450。在许多细菌和要铁硫蛋白的参与，即电子从 NAD( P) H 传递到还原酶递到 CYP450。合YP450 结合并发生第一次还原作用后，接下来是分子氧快的结合，产生氧化亚铁复合体，并自动形成超氧化物分子氧[16]。还原反应氧化 CYP450-底物复合体分解。细胞色素 b5 传递第二上，双氧键伸延变弱，最终裂解，一个氧原子进入底后形成 H2O。CYP450 释放后将催化下一次循环反应[17

苯丙烷,生物合成,羟化酶,黄酮

华中科技大学博士学位论文（图 1-4）。肉桂酸-4-羟化酶（C4H）是催化该途径第 2 步反，已在菊芋、绿豆等植物中被克隆出并得以功能鉴定[46, 47]。酸有着严格的专一性，且该酶在植物的各不同组织中都有着时，它参与的都是产生重要物质（如黄酮、呋喃香豆素、木故得以广泛关注。丙烷代谢途径的一个主要旁路是合成花色素苷。类黄酮 3’羟5’羟化酶（F3’5’H）催化底物生成类黄酮，两者在不同植物中花色不同[48-51]。凡是缺少 F3’5’H 的植物，都无法开出蓝色花）羟化底物 4-香豆酰基辅酶 A 形成四羟基查耳酮。此外，异异黄酮 3’-羟化酶（I3’H）也已有报道[53]。研究者在大丁草长 cDNA，在酵母中异源表达可以羟基化黄烷酮得到黄酮[54

【参考文献】