红毛菜科红藻的遗传育种与功能基因研究

发布时间：2020-08-07 05:51

【摘要】：海藻营养丰富,味道鲜美,且在制药、工业等领域都有广泛应用,因此市场对于海藻的需求不断增加。这一现象使我国海藻养殖业正在经历从稳步增长到快速增长的转变,养殖规模不断扩大,养殖技术也在不断优化更新,养殖品种更加多元化,条斑紫菜(Pyropia yezoensis)、坛紫菜(Pyropia haitanensis)红毛菜(Bangia)、海带(Saccharina Japonica)、羊栖菜(Hizikia fusifarme)等。本研究以同属红毛菜科红藻的条斑紫菜和红毛菜为实验材料,通过分子克隆和标记以及低盐胁迫的方法,针对随着海藻养殖业的发展而出现的一些问题进行了探究,以期为丰富北方海藻种质资源和更深入地了解其抗逆性生理生化响应提供依据。实验结果表明:以条斑紫菜优质品系为对照,不同海区栽培的“黄优1号”品系与野生亲本在各生化组分(藻胆蛋白、叶绿素a、类胡萝卜素和可溶性蛋白)含量上有明显差异。“黄优1号”在不同海区栽培藻体的藻胆蛋白含量均高于其亲本“野生群体1”,其中于日照海区培育的品系1b的各类藻胆蛋白的含量最高,呈显著性差异(p0.05),而相较于作为同海区优质条斑紫菜“对照品系”略低,但差异不显著(p0.05)。而对于叶绿素a(Chl a)和类胡萝卜素(Car)含量来说,“黄优1号”中来自日照的培育品系1b的各物质含量皆显著高于其亲本和其它培育品系以及来自同海区的优质条斑紫菜(p0.05)。对于可溶性蛋白(TSPs)来说,虽分为两个子集,但日照培育的“黄优1号”含量仍然最高,但与对照和野生2品系差异不显著(p0.05)。而同在南通海域栽培的“黄优1号”和培育品系2的各物质含量相差不大。以上结果说明,从野生群体中用合适的选育手段培育品质更佳的栽培品系(群体)具有可行性。而不同海区对“黄优1号”栽培藻体的品质有很大影响,其中于日照进行栽培的“黄优1号”藻体品质最佳。我们推测,来自北方的紫菜种质不适于生长在温度相差较大的南方海域,而日照海区的环境条件更适合“黄优1号”的生长。为做进一步了解,选用rbc L和COⅠ基因特异性扩增和AFLP分子标记技术对“黄优1号”条斑紫菜的遗传多样性进行了探究。基因扩增结果表明,基于rbc L序列(约1200 bp)仅砣矶岛养殖绳上全沉水生长的野生紫菜群体与其他品系(群体)具有1.1%的遗传差异,COⅠ序列(680 bp)也仅南通栽培的两个品系出现两个碱基的变异,其他品系(群体)与对照条斑紫菜序列完全一致。而AFLP分子标记结果用7对引物扩增出了249条清晰条带,其有248条为多态性条带,多态性百分比高达99.6%。遗传多样性分析显示,两个野生群体Wild 1、2的多态性最高,分别为47.39%和59.44%;三代“黄优1号”及两个对照组的多态性均在区间[20.08%,24.50%]内。聚类分析结果表明,大部分群体间遗传距离较为相近,多介于[0.0181,0.0758]内,而同为“黄优1号”的崂山栽培群体HYF2L和对照群体Control2与其它群体间的遗传距离较远,多介于[0.1325,0.2527]内,分析得到各群体间的遗传距离与养殖方式有关。由于同为全沉水生活方式的群体间遗传距离也相隔较远,我们推测:全沉水生活方式在条斑紫菜遗传多样性上起到了关键性的作用。用RACE方法成功克隆了质膜H+-ATPase基因PMHA1,5’-RACE与3’-RACE各获得一条明亮的特异性条带,长度分别为1000 bp和1800 bp。拼接后,获得全长为3368 bp的PMHA1基因c DNA,含有一个3129bp长的开放阅读框,编码1042个氨基酸,分子量为106.51 k D。综合其理化性质分析,预测的蛋白共包含29个α螺旋和35个β折叠以及19个蛋白激酶C、1个糖基化位点和3个氨基化位点以及77个磷酸化位点且分布复杂。我们将红毛菜的PMHA1蛋白与其他13个物种同源蛋白进行了比较分析,结果显示物种之间有一定的相似性,但红毛菜质膜H+-ATPase基因的差异较大。综合上述结果,我们推测较多的磷酸化位点会让红毛菜藻体受到外界胁迫刺激后,该蛋白的活性迅速提高,灵敏度高。其具有P型H+-ATPase家族的特征序列和保守结构域,但未发现与之匹配度高的同源序列。为了了解PMHA1的表达特征,应用实时荧光定量PCR方法检测该基因在不同程度的低盐胁迫下的红毛菜PMHA1基因相对表达量的变化,得到结果,该基因在不同程度的低盐胁迫下,表达量也明显发生改变,出现随海水占比减少表达量升高的趋势,且在同一盐度胁迫下,表达量随胁迫时间增长先升后降。综合上述结果我们发现,为了抵御外界环境胁迫,红毛菜藻体中的PMHA1基因表达量会上调以维持细胞内外化学势梯度,使藻体尽快适应胁迫逆境。但超过一定程度,生理响应机制会受损,无法继续进行自我调节。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4
【图文】：

红毛菜,条斑紫菜,果胞,原叶体

图 1-1 性成熟条斑紫菜叶状体和红毛菜原叶体a. 放大 400 倍的条斑紫菜雌雄生殖细胞混生显微观；b. 透明条状纹，即精子囊；c. 红毛果胞；d. 红毛菜精子囊）Fig.1-1 Sexual maturity of P. yezoensis leaf thallus and Bangia filamentous thallusa. Mosaic distribution of male and female reproductive cells of P. yezoensis; b. spermatangiumBangia carpogonium; d. Bangia spermatangium）1 紫菜生活史曾呈奎[12]等人在实验室内完成了紫菜的完整生活史循环。随着研究的不断，人们发现不同种类的紫菜生活史也不尽相同[13]。本文多选用条斑紫菜（Pyrzoensis）为实验材料，因此这里以条斑紫菜为例介绍生活史。王娟[14]等人将紫生活史分为了四类，而条斑紫菜是典型的异型配子体时代，包括孢子体世代（体）和配子体世代（叶状体），且同时具有无性生殖和有性生殖两种生殖方有性生殖中，成熟的紫菜叶状体的叶缘和叶梢部会形成果胞和精子囊（图 1-1成熟后，精子囊释放精子。此时的叶缘会呈现处透明的条状波纹（图 1-1b）条斑”二字也因此而得名[14]。受精果胞经过细胞分裂形成果孢子囊，后放散

条斑紫菜,生活史

上海海洋大学硕士学位论文无性生殖相对较简单，紫菜的叶状体阶段产生并释放单倍体的无性孢子子，可以萌发成叶状体[15、16]。在整个有性生殖过程中，从合子到壳孢子囊阶段的染色体皆为二倍体，成生殖细胞和放散壳孢子时发生减数分裂，又变成单倍体。而这种减数生只在有限的种类中得到了证实，如条斑紫菜[17]。在无性生殖生活史循体倍数始终不发生变化。紫菜完整的生活史如图 1-2[15]所示。

红毛菜,生活史

图 1-3 红毛菜生活史Fig.1-3 Life history of Bangia类分子生物学研究现状，分子生物技术快速发展，且已广泛应用于植物法，利用经典遗传学研究将生物体的表型与基因量品种[24]。若分子生物学研究基础薄弱，则不利标记技术的研究现状助育种主要包括，遗传多样性分析、杂种优势预面[26]。其中，遗传多样性是生物多样性的关键所和进化的可能性，一定程度上影响着物种的经济

【参考文献】